【操作程序】
1 樣本采集、存放及運(yùn)輸
1.1 樣本采集：
所用取樣器材必須經(jīng)高壓或干熱滅菌。
若樣品為活禽，建議取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子時(shí)將拭子深入喉頭口及上顎裂來回刮幾次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子時(shí)將拭子深入瀉殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便。然后將拭子一起放入盛有2ml PBS（含抗菌素）的試管，充分洗滌拭子，然后在管壁擠干液體，轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用。
若樣品為新鮮肌肉或臟器，取待檢樣品2g于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加10ml PBS混勻，取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用。為使樣品的代表性更強(qiáng)，也可取50克肉樣，加入50ml無菌的PBS液，用Bagmixer均質(zhì)器處理后，取上清備用。
若樣品為血清、血漿或冷凍組織滲出液，則直接取用。
1.2 存放：
分離后的樣本在2℃—8℃條件下保存應(yīng)不超過24hr； -70℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（*多凍融3次）。
1.3 運(yùn)輸：
采用或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。
2 樣本處理：
2.1  取n個(gè)1.5ml滅菌離心管（n = 樣本數(shù)+ 1管陰性對照+ 1管陽性對照），作好標(biāo)記。
2.2  首先加入600ul裂解液（裂解液即提取液，有很強(qiáng)的腐蝕性，切勿沾到皮膚或衣物，否則立即用大量清水沖洗并擦干），然后分別加入待測樣本、陰性對照、陽性對照各200ul（一份樣本換用一個(gè)吸頭）；再加入200ul氯仿，混勻器上振蕩混勻5sec（不宜過于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可用手顛倒混勻）。
2.3 于12,000g離心15min（如有條件，于4℃進(jìn)行離心）。
2.4  取與步驟2.1.1中相同數(shù)量的1.5ml滅菌離心管，加入400ul異丙醇（－20℃預(yù)冷），作好標(biāo)記。吸取步驟2.1.3各管中的上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中（上清液應(yīng)至少吸取500ul，注意不要吸出中間層，該層富含DNA和蛋白質(zhì)），顛倒混勻。
2.5  12,000g離心15min，（注意固定離心管方向，即將離心管開口朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體（不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干）；加入600ul 75%乙醇（－20℃預(yù)冷），顛倒洗滌。
2.6  12,000g離心10min，（注意固定離心管方向，即將離心管開口朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干）。
2.7  4,000g離心10sec（注意固定離心管方向，即將離心管開口朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置）將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干（一份樣本換用一個(gè)吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀一面），室溫干燥5-10min（不宜過于干燥，以免RNA不溶）。
2.8  加入11ul DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2,000g離心5sec，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁猓捍藭r(shí)的RNA*易受RNA酶降解，請?jiān)?小時(shí)內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增）。