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ELISA檢測實驗標準方法詳細介紹,速來圍觀!

點擊次數(shù):13171   發(fā)布時間:2017/9/21 9:36:09

 
     要使ELISA測定得到準確的結果,不論是定性的還是定量的,必須嚴格按照規(guī)定的方法制備試劑和實施測定。主要試劑的制備要點之前已經(jīng)講述過,其他一般性試劑,如包被緩沖液、洗滌液、標本稀釋液、結合物稀釋液、底物工作液和酶反應終止液等,配制時不可掉以輕心。緩沖液可于冰箱中短期保存,使用前應觀察是否變質(zhì)。蒸餾水的質(zhì)量在ELISA中也至關重要,使用新鮮重蒸餾的。不合格的蒸餾水可使空白值升高。

       測定的實施中,應力求各個步驟操作的標準化,下面以elisa試劑盒為例,介紹有關注意事項。

(一)加樣

      在ELISA中除了包被外,一般需進行45加樣。在定性測定中有時不強調(diào)加樣量的準確性,例如規(guī)定為加樣一滴。此時應該使用相同口徑的滴管,保持準確的加樣姿勢,使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應力求準確。標本和結合物的稀釋液應按規(guī)定配制。加樣時應將液體加在孔底,避免加在孔壁上部,并注意不可出現(xiàn)氣泡。

(二)保溫

      在ELISA中一般有二次抗原抗體反應,即加標本后和加結合物后,此時反應的溫度和時間應按規(guī)定的要求,保溫容器是水浴箱,可使溫度迅速平衡。各ELISA板不應疊在一起。為避免蒸發(fā),板上應加蓋,或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中。濕盒應該是金屬的,傳熱容易。如用保溫箱,空濕盒應預先放在其中,以平衡溫度,這在室溫較低時更為重要。加入底物后,反應的時間和溫度通常不做嚴格要求。如室溫高于20℃,ELISA板可避光放在實驗臺上,以便不時觀察,待對照管顯色適當時,即可終止酶反應。

(三)洗滌

      洗滌在ELISA過程中不是反應聚,但卻是決定實驗成敗的關鍵。洗滌的目的是洗去反應液中沒有與固相抗原或抗體結合的物質(zhì)以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA測定的反應過程中應盡量避免非特異性吸附,而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。在標本和結合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯(吐溫,Tween)一類物質(zhì)即右達到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯,為非離子型的表面張力物質(zhì),常作為助溶劑。根據(jù)脂肪酸的種類而對聚山梨酯編號,結合月桂酸的為聚山梨酯20,在ELISA中*為常用。它的洗滌效果好,并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結合的作用。

      洗滌如不徹底,特別在*后一次,如有酶結合物的非特異性吸附,將使空白值升高。另外,在間接法中如血清標本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈,也將與酶標抗體作用而產(chǎn)生干擾。

      ELISA板的洗滌一般可采用以下方法:①吸干孔內(nèi)反應液;②將洗滌液注滿板孔;③放置2min,略作搖動;④吸干孔內(nèi)液,也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為3~4次,有時甚至需洗5~6次。

(四)比色

       如陰性對照顏色極淺,在定性測定中一般可采用目視比色。如用比色計測定結果,準確性決定于ELISA板底的平整與透明度和比色計的質(zhì)量。

原創(chuàng)作者:上海恒遠生物科技有限公司

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