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點(diǎn)擊次數(shù):13301 發(fā)布時(shí)間:2020/1/15 9:26:31
活體光學(xué)成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)技術(shù)與熒光(fluorescence)技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA,今天,生物發(fā)光標(biāo)記物可以標(biāo)記到任何一種基因上,使對(duì)基因功能的全面細(xì)致研究成為現(xiàn)實(shí)。而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)(GFP、RFP,Cyt及dyes等)進(jìn)行標(biāo)記,利用熒光蛋白在外源光源或是內(nèi)源發(fā)光照射下被激發(fā)產(chǎn)生的熒光作為檢測信號(hào)。研究人員能夠利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。
該技術(shù)可被廣泛應(yīng)用于標(biāo)記細(xì)胞或基因的示蹤及檢測;基因治療(gene therapy)在活體動(dòng)物體內(nèi)直接的觀察和檢測;基因組、蛋白組學(xué)、藥學(xué)及生物技術(shù)在活體動(dòng)物內(nèi)的研究;藥物及化學(xué)合成藥物的藥物代謝及毒理學(xué)監(jiān)測;食品菌落生長成像;皮膚醫(yī)學(xué)中皮膚疾病的體內(nèi)成像;法醫(yī)鑒定;微孔板成像,例如:免疫分析、報(bào)告基因、基因探針和嗜菌作用分析等;熒光團(tuán)的體內(nèi)成像,例如:Alzheimer疾病研究中結(jié)合嗪的β-淀粉沉淀物分析;轉(zhuǎn)基因植物(transgenic plant)中通過報(bào)告基因?qū)ι碇芷诠?jié)奏的研究;凝膠成像分析等等。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 用熒光色素DiD標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞
1) 先用胰蛋白酶消化待標(biāo)記材料,使之成為一定密度的懸浮液;
2) 從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出間充質(zhì)干細(xì)胞,吸取含原有培養(yǎng)基的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行標(biāo)記;
3) 用10 ml Mg/Ca-free PBS (不含鈣鎂離子的磷酸緩沖液)清洗細(xì)胞,吸去PBS,鈣鎂離子會(huì)影響胰蛋白酶的活性,必須小心;
4) 加入預(yù)熱的0.05% 胰蛋白酶液,加液量以T75型瓶為例,每瓶加5ml,確保瓶的表面被完全覆蓋;
5) 在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37° C 孵育約 5 分鐘;
6) 然后在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞已經(jīng)完全分散,如果有細(xì)胞貼壁情況,輕拍若干次或延長孵育時(shí)間直至酶解消化完全成功;
7) 加入等量含 10% FCS的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶;
8) 用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散;
9) 然后移取細(xì)胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中;
10) 400 RCF離心5 分鐘;
11) 小心移去上清液,不要擾動(dòng)細(xì)胞;
12) 將細(xì)胞重新懸浮于DMEM 并進(jìn)行計(jì)數(shù);
13) 需要待標(biāo)記細(xì)胞在無血清DMEM溶液中的密度應(yīng)為1x106/ml ;
14) 每ml細(xì)胞懸浮液加入5 μL DiD 染色液;
15) 用移液器將染色液與細(xì)胞懸浮液混合均勻;
16) 在6孔低附著性細(xì)胞板上37°C 孵育20分鐘;
17) 孵育完全后移取細(xì)胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中;
18) 400 RCF離心5 分鐘;
19) 小心移去染色液,不要擾動(dòng)細(xì)胞;
20) 用PBS清洗細(xì)胞,用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散;
21) 重復(fù)洗三次;
22) 細(xì)胞重新計(jì)數(shù)并用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性;
23) 進(jìn)行活細(xì)胞成像。
2. 用熒光色素ICG標(biāo)記人胚胎干細(xì)胞
1) 必須先準(zhǔn)備好吲哚菁綠溶液(血容量、心輸出量、肝功能測定劑)作為對(duì)照品,然后使之與轉(zhuǎn)染試劑魚精蛋白(抗凝血作用)混合;
2) 測出1ml吲哚菁綠溶液的活力,然后在100 μL DMSO中溶解ICG;
3) 向混合物中加入 400 μL Dulbecco的改良Eagles 培養(yǎng)基 (DMEM加10% 胎牛血清),震蕩均勻,吲哚菁綠溶液終濃度為2mg/ml;
4) 加入轉(zhuǎn)染試劑魚精蛋白,魚精蛋白作為對(duì)照品的載體,使之能夠有效進(jìn)入細(xì)胞;
5) 在300 μL ICG 和 300 μL 無血清Dulbecco改良 Eagles 培養(yǎng)基中混入 5 μL 硫酸魚精蛋白溶液,使之終濃度為 10mg/ml,;
6) 震蕩5分鐘使之形成復(fù)合物,標(biāo)記溶液制備完畢;
7) 從 hESC 10mm Petri 培養(yǎng)皿中移去原有培養(yǎng)基;
8) 加入5ml預(yù)熱的 DMEM;
9) 加入制備好的魚精蛋白/ICG 溶液, 37°C下孵育1h;
10) 孵育完全后移去染色液;
11) 用5 ml PBS漂洗培養(yǎng)皿以清除染色液;
12) 移去 PBS 再加入 5ml 0.25 % 胰蛋白酶液,37°C下孵育5分鐘使之酶解,適當(dāng)震搖培養(yǎng)皿效果會(huì)更好;
13) 用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散;
14) 加入等量含 10% KSR的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶;
15) 然后移取細(xì)胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中,400 RCF離心5 分鐘;
16) 在全培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞;
17) 如果還有細(xì)胞團(tuán)塊,可以移去原有培養(yǎng)基用10ml預(yù)熱的全ESC培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞,重復(fù)酶解再離心;
18) 在這一點(diǎn)上,鼠源飼喂細(xì)胞需從hESCs中分離;
19) 然后將細(xì)胞懸浮液移至涂布瓊脂的10 cm 培養(yǎng)皿中;
20) 37°C 孵育 45 分鐘,注意不要晃動(dòng)培養(yǎng)皿,如此鼠源飼喂細(xì)胞會(huì)貼壁而干細(xì)胞保持懸。
21) 從Petri 培養(yǎng)皿中移出已標(biāo)記的單細(xì)胞人胚胎干細(xì)胞懸浮液;
22) 細(xì)胞重新計(jì)數(shù)并用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性;
23) 進(jìn)行活細(xì)胞成像。
原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
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