免疫熒光技術(shù)有兩種檢測(cè)方法:用熒光標(biāo)記抗體示蹤或檢測(cè)相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法;用已知的熒光標(biāo)記抗原示蹤或檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。(熒光抗體方法較常用)
1.在開始實(shí)驗(yàn)研究,有哪些因素需要考慮?
(1)根據(jù)抗原選擇合適的抗體,確認(rèn)抗原可以識(shí)別哪一種異構(gòu)體以及抗原表位的位置。
(2)確認(rèn)目的蛋白在該樣本中是否表達(dá)。
(3)根據(jù)所要研究的目標(biāo)蛋白來(lái)確定合適的樣本類型(石蠟切片、冰凍切片還是細(xì)胞制備物等)。
(4)選擇抗體時(shí)需要考慮該抗體的物種交叉反應(yīng)。
(5)關(guān)于蛋白,需要考慮它的組織定位和細(xì)胞定位,以及染色時(shí)是否應(yīng)該有信號(hào)。
(6)選擇合適的固定方法及抗原修復(fù)方法。
(7)抗體的工作濃度或稀釋比例,以及抗體的物種來(lái)源也是需要考慮的重要因素。
2.免疫組化實(shí)驗(yàn)里為什么要對(duì)樣品進(jìn)行處理?
樣品處理是為了調(diào)控樣本中蛋白的表達(dá)水平,如果是細(xì)胞實(shí)驗(yàn),就需要使用適當(dāng)?shù)囊种苿┗蚣せ顒﹣?lái)上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞中某種蛋白質(zhì)的表達(dá);如果是體內(nèi)實(shí)驗(yàn),就需要考慮更多的因素,因?yàn)閷?shí)驗(yàn)對(duì)象是活的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,在選擇抑制劑或激活劑、激動(dòng)劑或拮抗劑時(shí),應(yīng)盡量避免由于非特異性結(jié)合其它蛋白所導(dǎo)致的非特異性效應(yīng)。對(duì)于某些特殊試驗(yàn)樣品,比如腦,我們需要確保細(xì)胞的滲透性,讓化合物能真正進(jìn)入細(xì)胞或血腦屏障。另外需要確保所使用的化學(xué)品能夠溶于合適的溶劑,還有確定適合的給藥途徑(注射或口服)。
3.請(qǐng)問(wèn)如何根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)對(duì)象來(lái)選擇不同的樣本形式呢?
對(duì)于細(xì)胞制備物,它們常見的形式是涂片或培養(yǎng)的細(xì)胞系。對(duì)于組織樣本,常用的是石蠟包埋的組織切片,福爾馬林固定。是因?yàn)樗鼈兡軌虮3纸M織形態(tài)與蛋白抗原性之間的zui佳平衡。石蠟包埋的組織切片很穩(wěn)定,并且易于使用。但它的不足之處是很耗時(shí)(需要對(duì)切片進(jìn)行脫蠟處理和抗原修復(fù))。一般來(lái)說(shuō),石蠟切片適用于4微米厚的切片。如果切片厚度大于4微米,抗體可能會(huì)被困住,導(dǎo)致假陽(yáng)性染色,這是我們需要避免的。
另一種常見的樣本形式是冰凍組織切片,這對(duì)于不能經(jīng)受醛固定處理和石蠟處理的抗原來(lái)說(shuō)非常理想,因此這些抗原將呈現(xiàn)出更天然的狀態(tài),但冰凍切片的缺點(diǎn)是組織形態(tài)可能不佳。冷凍切片通常僅適用于厚度為4-10微米的薄切片,超過(guò)這個(gè)厚度的切片可能會(huì)困住抗原,導(dǎo)致假陽(yáng)性染色結(jié)果。如果要研究的組織類型無(wú)法做成這種厚度的薄切片,可以考慮采用漂片。該技術(shù)一般用于腦組織和脊髓,在發(fā)育研究中,這是一項(xiàng)非常有用的技術(shù),可用于厚度達(dá) 40 微米的更大切片。缺點(diǎn)是操作起來(lái)更加不便,整個(gè)過(guò)程中組織樣品都處于自由漂浮狀態(tài),之后還必須將它們固定在載玻片上進(jìn)行觀察,操作有一定的難度;另一個(gè)缺點(diǎn)就是非常耗時(shí)。
原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司