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輕松掌握細(xì)胞凋亡檢測實驗的方法

點擊次數(shù):12122   發(fā)布時間:2024/1/19 9:47:02

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞主動有序的死亡,它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用,它并不是病理條件下自體損傷的一種現(xiàn)象,而是為了更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡。本期恒遠(yuǎn)生物給大家介紹細(xì)胞凋亡檢測實驗的方法,一起來學(xué)習(xí)下吧!

一、PI 單染色法
1. 收集細(xì)胞{數(shù)目約(1~ 5)×106 個/mL},500 ~ 1000 r/min 離心 5min,棄去培養(yǎng)液。
2. 3ml PBS 洗滌 1 次。
3. 離心去 PBS,加入冰預(yù)冷的 70%的乙醇固定,4℃,1—2 小時。
4. 離心棄去固定液,3mlPBS 重懸 5min。
5. 400 目的篩網(wǎng)過濾 1 次,500—1000r/min 離心 5min,棄去 PBS。
6. 用 1ml PI 染液染色,4℃避光 30min。
7. 流式細(xì)胞儀檢測:PI 用氬離子激發(fā)熒光,激光光波波長為 488nm,發(fā)射光波波長大于630nm,產(chǎn)生紅色熒光分析 PI 熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析散射光對側(cè)散射光的散點圖。
8. 結(jié)果判斷:在散射光對側(cè)散射光的散點圖或地形圖上,凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞相比,散射光降低,而側(cè)散射光可高可低,與細(xì)胞的類型有關(guān);在分析 PI 熒光的直方圖時,先用門技術(shù)排除成雙或聚集的細(xì)胞以及發(fā)微弱熒光的細(xì)胞碎片,在 PI 熒光的直方圖上,凋亡細(xì)胞在G1/G0 期出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以 G1/G0 期所在位置的熒光強(qiáng)度為 1.0,則一個典型的凋亡細(xì)胞樣本其亞二倍體峰的熒光強(qiáng)度為 0.45,可用雞和鮭魚的紅細(xì)胞的 PI 熒光強(qiáng)度做參照標(biāo)準(zhǔn),兩者分別為 0.35 和 0.7,可以確保在兩者之間的不是細(xì)胞碎片而是完整的細(xì)胞。

注意事項:
細(xì)胞凋亡時,其 DNA 可染性降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志,但這種 DNA 可染性降低也可能是因為 DNA 含量的降低,或者是因為 DNA 結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時應(yīng)該注意。

二、Annexin V/PI 雙染色法

1. 細(xì)胞收集:懸浮細(xì)胞直接收集到 10ml 的離心管中,每樣本細(xì)胞數(shù)為(1~5)×106,/mL 500~1000r/min 離心 5min,棄去培養(yǎng)液。
2. 用孵育緩沖液洗滌 1 次,500~1000r/min 離心 5min。
3. 用 100ul 的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞,室溫下避光孵育 10~15min。
4. 500~1000r/min 離心 5min 沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗 1 次。
5. 加入熒光(SA-FLOUS)溶液 4℃下孵育 20min,避光并不時振動。
6. 流式細(xì)胞儀分析:流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用 488nm,用一波長為 515nm 的通帶濾器檢測 FITC 熒光,另一波長大于 560nm 的濾器檢測 PI。
7. 結(jié)果判斷:凋亡細(xì)胞對所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如 PI 有抗染性,壞死細(xì)胞則不能。

總結(jié):細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的 DNA 可被 PI 著染產(chǎn)生紅色熒光,而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此,在細(xì)胞凋亡的早期 PI 不會著染而沒有紅色熒光信號。正;罴(xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點圖上,左下象限顯示活細(xì)胞,為(FITC-/PI-);右上象限是非活細(xì)胞,即壞死細(xì)胞,為(FITC+/PI+);而右下象限為凋亡細(xì)胞,顯現(xiàn)(FITC+/PI- )

三、Heochst 33342/PI 雙染色法

1. 懸浮生長的細(xì)胞在培養(yǎng)的狀態(tài)下加入 Heochst 33342 ,終濃度為 1ug/ml; 37℃孵育7—10min。
2. 低溫 500 ~ 1000r/min 離心 5min 棄去染液。
3. 加入 1.0ml PI 染液,4℃避光染色 15min。
4. 400 目的篩網(wǎng)過濾 1 次。
5. 流式細(xì)胞儀分析:Heochst 33342 用氪激光激發(fā)的紫外線熒光,激發(fā)光波波長為352nm,發(fā)射光波波長為 400 ~ 500nm,產(chǎn)生蘭色熒光;PI 用氬離子激光激發(fā)熒光,激發(fā)光波波長為 488nm,發(fā)射光波波長大于 630nm,產(chǎn)生紅色熒光。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。
6. 結(jié)果判斷:在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上,結(jié)果為:正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光,凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光,壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光。 

注意事項:
① 在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上,還可見到細(xì)胞凋亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡,可能是凋亡細(xì)胞的 DNA 進(jìn)一步降解的緣故。
② 用 Heochst 33342 染料與細(xì)胞孵育的時間不宜過長,一般控制在 20min 之內(nèi)為宜。如果太長可引起 Heochst 33342 的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移,導(dǎo)致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變,從而影響結(jié)果的判斷。

更多實驗資訊可咨詢我司業(yè)務(wù)員。上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司擁有自己的實驗室,備有業(yè)的技術(shù)研發(fā)團(tuán)隊,于各種生物試劑,細(xì)胞,血清,ELISA試劑盒的研發(fā)與銷售,實驗提供免費代測服務(wù),并提供精湛的技術(shù)服務(wù),如果您有實驗上的問題歡迎來咨詢,為您提供業(yè)的一對一技術(shù)指導(dǎo)。 

原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司

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