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恒遠(yuǎn):胞集落形成實驗

閱讀次數(shù):2002   發(fā)布時間:2012/9/3 14:04:03

 

 

 細(xì)胞集落形成實驗

非整倍體無限細(xì)胞系和癌細(xì)胞株中,仍然存在不同細(xì)胞亞群,它們的功能和生長特點有些差異,其中有些亞群細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境有較大的適應(yīng)性和具有較強(qiáng)的獨立生存能力,細(xì)胞集落率高。純化細(xì)胞群來自一個共同的祖細(xì)胞,細(xì)胞遺傳性狀、生物學(xué)特性相似,利于實驗研究。原代培養(yǎng)細(xì)胞和二倍體有限細(xì)胞系,細(xì)胞集落率很低。細(xì)胞集落化培養(yǎng)之前,應(yīng)先測定細(xì)胞集落形成率,以了解細(xì)胞在極低密度條件下的生長能力。

目前認(rèn)為僅有腫瘤干細(xì)胞具有形成集落的能力,集落抑制率常用于抗癌藥物敏感試驗、腫瘤放射生物學(xué)試驗。

集落抑制率=(1-(實驗組集落形成率/對照組集落形成率))×100%

(一)原理

細(xì)胞集落形成率 單個細(xì)胞在體外增殖6代以上,其后代所組成的細(xì)胞群體,稱為集落或克隆。每個克隆含有50個以上的細(xì)胞,大小在0.3-1.0mm 之間。集落形成率表示細(xì)胞獨立生存能力。常用方法有平板集落形成試驗、軟瓊脂集落形成試驗。

(二)實驗用品

1.材料:Hela細(xì)胞。

2.器材:(直徑 60mm )培養(yǎng)皿、細(xì)胞記數(shù)板、燒杯、吸管、離心機(jī)、離心管、廢液瓶、倒置顯微鏡、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺、水浴鍋。

3.試劑:Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清細(xì)胞培養(yǎng)液、安爾碘、瓊脂。

(三)方法

1.平板克隆形成試驗

本法適用于貼壁生長的細(xì)胞,包括培養(yǎng)的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。

(1)對指數(shù)生長期細(xì)胞,采用常規(guī)消化傳代方法,制成細(xì)胞懸液。

(2)細(xì)胞懸液反復(fù)吹打,使細(xì)胞充分分散,單個細(xì)胞百分率應(yīng)在95%以上。細(xì)胞記數(shù),并用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度,待用。

(3)根據(jù)細(xì)胞增殖能力,將細(xì)胞懸液倍比稀釋。一般按照每皿含50、100、200個細(xì)胞的濃度分別接種5ml細(xì)胞懸液到培養(yǎng)皿(直徑 60mm )中,以十字方向輕輕晃動培養(yǎng)皿,使細(xì)胞分散均勻。

(4)培養(yǎng)皿置 37℃ 、5%CO2中培養(yǎng)2~3周,中間根據(jù)培養(yǎng)液pH變化適時更換新鮮培養(yǎng)液。

(5)當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見克隆時,終止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)液,PBS液小心浸洗2次,空氣干燥。甲醇固定15分鐘,棄甲醇后空氣干燥。用Giemsa染液染色10分鐘,流水緩慢洗去染液,空氣干燥。

2.軟瓊脂集落形成試驗

本法適用于非錨著依賴性生長的細(xì)胞,如骨髓造血干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞株、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。利用瓊脂液無粘著性又可凝固的特性,將腫瘤細(xì)胞混入瓊脂液中,瓊脂液凝固使腫瘤細(xì)胞置于一定位置,瓊脂中腫瘤細(xì)胞可能向周圍作全方位的移動,因此可以用來檢測腫瘤細(xì)胞的主動移動能力。腫瘤細(xì)胞在適宜培養(yǎng)基中又可以增殖,從而可以測定腫瘤細(xì)胞克隆形成率。造血系統(tǒng)軟瓊脂集落形成試驗方法相同,主要用于有關(guān)細(xì)胞分化的研究,但使用培養(yǎng)基不同。

(1)同上(1)~(3)步驟。

(2)調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×103個/ml細(xì)胞。

(3)制備底層瓊脂,完全溶化的5%瓊脂和 37℃ 左右預(yù)溫的新鮮完全培養(yǎng)液以1:9比例在 40℃ 均勻混合,加入培養(yǎng)皿(直徑 60mm )中,每皿含0.5%瓊脂培養(yǎng)基2ml,室溫下瓊脂完全凝固。

(4)制備上層瓊脂,取 37℃ 不同密度梯度(按照每皿含50、100、200個)的細(xì)胞懸液1.5ml移入小燒杯中,加入 40℃ 、5%瓊脂等體積混勻,即成0.25%半固體瓊脂培養(yǎng)基。配好的半固體瓊脂培養(yǎng)基立即加入鋪有底層瓊脂的培養(yǎng)皿中,室溫下瓊脂凝固。 37℃ 、5%CO2靜置培養(yǎng)2-3周。

(四)實驗結(jié)果

1.定期觀察細(xì)胞培養(yǎng)過程中集落的形成。

2.顯微鏡下計數(shù)大于50個細(xì)胞克隆數(shù),然后按下式計算集落形成率:

集落形成率(%)=(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100

(五)注意事項

1.瓊脂對熱和酸不穩(wěn)定,如果反復(fù)加熱,容易降解,產(chǎn)生毒性,同時瓊脂硬度下降。故瓊脂高壓滅菌( 10磅 15分鐘)后按一次用量進(jìn)行分裝。

2.細(xì)胞懸液中,細(xì)胞分散度>95%。

3.軟瓊脂培養(yǎng)時,注意瓊脂與細(xì)胞混合時溫度不要超過 40℃ ,以免燙傷細(xì)胞。

4.接種細(xì)胞密度不宜過高。

5.細(xì)胞在低密度條件下培養(yǎng),生存率明顯下降,無限細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞株克隆形成率一般在10%以上。但初代培養(yǎng)細(xì)胞和有限細(xì)胞系僅為0.5~5%,甚至為零。為提高集落形成率,必要時在培養(yǎng)基中添加胰島素、地塞米松等促細(xì)胞克隆形成物質(zhì)。

(六)復(fù)習(xí)思考題

比較平板克隆形成試驗和軟瓊脂集落形成試驗的異同。

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