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上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司主要經(jīng)營(yíng)的產(chǎn)品有：elisa試劑盒，生物試劑，標(biāo)準(zhǔn)品，血清，抗體，培養(yǎng)基，細(xì)胞，歡迎前來(lái)咨詢。
Gregory D.Schuler
National Center for Biotechnology Information
National Library of Medicine. National Institutes of Health
Bethesda. Maryland
引言
在生物學(xué)的研究中,有一個(gè)常用的方法,就是通過(guò)比較分析獲取有用的信息和知識(shí)。達(dá)爾文正是研究比較了galapagos finches同其它一些物種的形態(tài)學(xué)特征，從而提出了自然選擇學(xué)說(shuō)。今天，我們對(duì)基因和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較，從本質(zhì)上來(lái)講是同達(dá)爾文一樣，進(jìn)行同樣的分析，只不過(guò)更加精細(xì)，更加詳盡。在這個(gè)意義上，我們從核酸以及氨基酸的層次去分析序列的相同點(diǎn)和不同點(diǎn)，以期能夠推測(cè)它們的結(jié)構(gòu)、功能以及進(jìn)化上的聯(lián)系。*常用的比較方法是序列比對(duì)，它為兩個(gè)或更多個(gè)序列的殘基之間的相互關(guān)系提供了一個(gè)非常明確的圖譜。在這一章，我們只討論一下雙重比對(duì)，即只比較兩個(gè)序列，至于較多的序列即多序列比對(duì)，將在第八章介紹。
七十年代以來(lái)，DNA測(cè)序方法的飛速發(fā)展，極大地引發(fā)了序列信息量的擴(kuò)增，從而使可供比較的序列數(shù)量呈現(xiàn)爆炸式增長(zhǎng)。分子生物學(xué)家應(yīng)該意識(shí)到，將未知序列同整個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比較分析已經(jīng)成為他們手中一個(gè)強(qiáng)有力的研究手段。在過(guò)去的三十年里，即使不提及計(jì)算機(jī)的應(yīng)用，序列比較的各種算法也已經(jīng)發(fā)展得越來(lái)越迅速，也越來(lái)越成熟，已經(jīng)能夠跟上序列數(shù)據(jù)庫(kù)增長(zhǎng)的步伐。今天，我們已經(jīng)擁有一些小的模式物種的基因組的全序列，還擁有人類基因序列的一些較大的樣品，我們已經(jīng)進(jìn)入比較基因組時(shí)代，也就是說(shuō)，對(duì)兩個(gè)物種進(jìn)行全基因組序列比較已經(jīng)不再是一個(gè)夢(mèng)想。
序列比對(duì)的進(jìn)化基礎(chǔ)
進(jìn)行序列比對(duì)的目的是讓人們能夠判斷兩個(gè)序列之間是否具有足夠的相似性，從而判定二者之間是否具有同源性。值得注意的是，相似性和同源性雖然在某種程度上具有一致性，但它們是完全不同的兩個(gè)概念。相似性是指一種很直接的數(shù)量關(guān)系，比如部分相同或相似的百分比或其它一些合適的度量，而同源性是指從一些數(shù)據(jù)中推斷出的兩個(gè)基因在進(jìn)化上曾具有共同祖先的結(jié)論，它是質(zhì)的判斷。基因之間要么同源，要么不同源，絕不象相似性那樣具有多或少的數(shù)量關(guān)系。如圖7.1所示，比較家鼠和小龍蝦的同源的胰蛋白酶序列，發(fā)現(xiàn)它們具有41%的相似性。
由于受到研究進(jìn)化關(guān)系這一目的的影響，大多數(shù)比對(duì)方法很自然地都希望能夠在某種程度上建立起分子進(jìn)化的模型。我們通常都假定同源序列是從某一共同祖先不斷變化而來(lái)，但事實(shí)上，我們無(wú)法得知這個(gè)祖先序列到底是什么樣子，除非能夠從化石中獲得它的DNA，我們所能夠做到的只是從現(xiàn)存物種中，探求真相。從祖先序列以來(lái)所發(fā)生的變化包括取代、插入以及缺失。在理想情況下，同源基因或蛋白質(zhì)序列在相互比較時(shí)，殘基之間相互對(duì)應(yīng)，從而使取代的情況很明顯地表現(xiàn)出來(lái)。在某些位置，一個(gè)序列中擁有某些殘基而另一個(gè)序
Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes ａnd Proteins Edited by A.D.Baxevanis ａnd B.F.F.Ouellette ISBN 0-471-19196-5.pages 145-171. Copyright© 1998 Wiley-Liss. Inc.
列中缺少這種殘基，表明這些殘基是插入到前者或是從后者中丟失的。這些空位在序列比對(duì)時(shí)用連續(xù)的短線填補(bǔ)。如圖7.1，在序列比對(duì)中，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)空位。
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Mouse IVGGYNCEENSVPYQVSLNS－－－－-GYHFCGGSLINEQWVVSAGHCYK－－－－－－-SRIQV Crayfish IVGGTDAVLGEFPYQLSFQETFLGFSFHFCGASIYNENYAITAGHCVYGDDYENPSGLQI * Mouse RLGEHNIEVLEGNEQFINAAKIIRHPQYDRKTLNNDIMLIKLSSRAVINARVSTISLPTA Crayfish VAGELDMSVNEGSEQTITVSKIILHENFDYDLLDNDISLLKLSGSLTFNNNVAPIALPAQ |－－－－ S-S－－－－－－－－| Mouse PPATGTKCLISGWGNTASSGADYPDELQCLDAPVLSQAKCEASYPG-KITSNMFCVGFLE Crayfish GHTATGNVIVTGWG-TTSEGGNTPDVLQKVTVPLVSDAECRDDYGADEIFDSMICAGVPE ◇ *|－－－－－－－－－－－－-S-S－－－－－－－－－－－－－－－－－－| Mouse GGKDSCQGDSGGPVVCNG－－－－QLQGVVSWGDGCAQKNKPGVYTKVYNYVKWIKNTIAAN Crayfish GGKDSCQGDSGGPLAASDTGSTYLAGIVSWGYGCARPGYPGVYTEVSYHVDWIKANAV－－
圖7.1、保守位點(diǎn)通常在功能上極為重要。對(duì)老鼠的胰蛋白酶（Swiss-Prot P07146）和小龍蝦的胰蛋白酶（Swiss-Prot P00765）作比對(duì)，相同的殘基用下標(biāo)線標(biāo)出，在比對(duì)上方標(biāo)出的是三個(gè)二硫鍵（-S-S），這些二硫鍵中的半胱氨酸殘基極為保守，打星號(hào)的殘基的側(cè)鏈參與電荷傳遞系統(tǒng)，打菱形符號(hào)的活性位點(diǎn)的殘基負(fù)責(zé)底物的特異性。
在殘基-殘基比對(duì)中，很明顯，某些位置的氨基酸殘基相對(duì)于其它位置的殘基具有較高的保守性，這個(gè)信息揭示了某些殘基對(duì)于一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能是極為重要的。如圖7.1所示，處于活性位點(diǎn)的殘基都是極為保守的，比如形成二硫鍵的半胱氨酸，參與電子傳遞的氨基酸殘基以及決定底物特異性的氨基酸殘基。這些保守的殘基對(duì)于保持蛋白的結(jié)構(gòu)與功能非常重要，另一方面，由于歷史原因，某些保守位置對(duì)蛋白功能并無(wú)太大的重要性。當(dāng)我們處理非常相近的物種時(shí)必須十分小心，因?yàn)橄嗨菩栽谀承┣闆r下更多地是歷史的反映而不是功能的反映，比如，mouse和rat的某些序列具有高度的相似性，可能僅僅是因?yàn)闆](méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行分化而已。盡管如此，系列比對(duì)仍然是從已知獲得未知的一個(gè)十分有用的方法，比如通過(guò)比較一個(gè)新的蛋白同其它已經(jīng)經(jīng)過(guò)深入研究的蛋白，可以推斷這個(gè)未知蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的某些性質(zhì)。必須指出的是，不能夠僅僅是通過(guò)比較分析這一判據(jù)來(lái)斷定結(jié)論是否正確，結(jié)論還必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因或蛋白質(zhì)具有驚人的相似性時(shí)，我們會(huì)認(rèn)為他們之間具有一段共同的進(jìn)化歷程，從而我們判斷他們會(huì)具有相似的生物學(xué)功能，但是，這個(gè)推斷在成為結(jié)論之前必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。例如，ζ-晶狀物是脊椎動(dòng)物眼睛里晶狀體基質(zhì)的組成部分，根據(jù)序列相似性的基礎(chǔ)，它在E.coli中的同源物是代謝酶苯醌氧化還原酶（如圖7.2），不管二者的共同祖先如何，它們的功能在進(jìn)化中已經(jīng)改變了（Gonzalez et al.,1994）。這就好象火車(chē)變成了鐵路餐車(chē)，雖然對(duì)二者的外部結(jié)構(gòu)的觀察揭示了它們結(jié)構(gòu)的歷史，但是僅僅根據(jù)這一信息往往會(huì)得出有關(guān)其功能的錯(cuò)誤結(jié)論。當(dāng)一個(gè)基因適應(yīng)了一個(gè)新的功能時(shí)，保守位置通常也會(huì)發(fā)生一些形式上的變化，比如，當(dāng)?shù)鞍拙哂写呋δ軙r(shí)，活性為點(diǎn)的殘基相當(dāng)保守，而當(dāng)?shù)鞍坠δ芨淖儠r(shí)，這些殘基將會(huì)發(fā)生漂移。
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圖7.2、*佳全局比對(duì)：對(duì)人類ζ-晶狀物（Swiss-Prot Q08257）和E.coli苯醌氧化還原酶（Swiss-Prot P28304）的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。這是一個(gè)由CLUSTAL W程序（Higgins et al., 1996）得到的*佳全局比對(duì)結(jié)果。在比對(duì)下方，星號(hào)表示殘基相同，打點(diǎn)表示這個(gè)殘基是保守的。
早期的序列比對(duì)方法只應(yīng)用于那些在全長(zhǎng)范圍內(nèi)具有簡(jiǎn)單相似性的一些序列。全序列比對(duì)就是對(duì)序列進(jìn)行全程掃描，進(jìn)行比較。以上討論的胰蛋白酶和ζ-晶狀物之間的比較就屬于全序列比對(duì)。具有簡(jiǎn)單的球形結(jié)構(gòu)域的蛋白一般可以使用全序列比對(duì)的策略，以為所有的同源序列尚未經(jīng)過(guò)實(shí)質(zhì)上的變化
蛋白質(zhì)的模塊性質(zhì)
許多蛋白質(zhì)在全程范圍內(nèi)并不具有相似性，但卻似乎是由眾多的模塊結(jié)構(gòu)域搭建而成。圖7.3描述了這樣的一個(gè)例子，如圖所示的是在血凝過(guò)程中的兩種蛋白的組成結(jié)構(gòu)，它們是凝血因子XII（F12）和組織型血纖蛋白溶酶原活化因子（PLAT），除了具有絲氨酸蛋白酶活性的催化結(jié)構(gòu)域，這兩種蛋白還具有不同數(shù)量的其它結(jié)構(gòu)域單元，包括兩種纖連蛋白重復(fù)，一個(gè)類似于上皮生長(zhǎng)因子的結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)成為“kringle”域的單元。這些組分可以以不同順序反復(fù)出現(xiàn)，組分形式的不同通常是由于整個(gè)外顯子交換引起的。由于全程比對(duì)建立時(shí)，基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)還沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，因此全程比對(duì)并沒(méi)有顧及到上述現(xiàn)象的重要性，這是可以理解的。在大多數(shù)情況下，使用局部比對(duì)是較為合理的，這種比對(duì)方法可能會(huì)揭示一些匹配的序列段，而本來(lái)這些序列段是被一些完全不相關(guān)聯(lián)的殘基所淹沒(méi)的，因此，操作者應(yīng)該明白，如果不恰當(dāng)?shù)厥褂昧巳瘫葘?duì)，很可能會(huì)掩埋一些局部的相似性。設(shè)計(jì)局部比對(duì)的另外一個(gè)很明顯的原因就是在比較一個(gè)拼接后的mRNA和它的基因序列時(shí)，每個(gè)外顯子都應(yīng)該進(jìn)行局部比對(duì)。
圖7.3、血凝過(guò)程中的兩中蛋白的模塊結(jié)構(gòu)：人類組織血纖蛋白溶酶原活化因子以及凝血因子XII的模塊結(jié)構(gòu)的示意圖。標(biāo)記為Catalytic的模塊在若干種凝血蛋白中是常見(jiàn)的，F1和F2是較為常見(jiàn)的重復(fù)模塊，首先在纖連蛋白中被發(fā)現(xiàn)。E模塊同表皮生長(zhǎng)因子極為類似。通常稱為”Kringle domain”的模塊被標(biāo)記為K。
點(diǎn)陣描述方法之所以廣泛流行，其部分原因就在于它能夠揭示出擁有多個(gè)局部相似性的復(fù)雜關(guān)系，圖7.4就是應(yīng)用這種處理后的一個(gè)例子。圖中F12和PLAT蛋白質(zhì)序列使用DOTTER程序進(jìn)行比較（軟件可見(jiàn)本章結(jié)尾列表），其基本思路就是把兩個(gè)序列分別作為一個(gè)二維坐標(biāo)系中的兩個(gè)坐標(biāo)軸，在這個(gè)坐標(biāo)系區(qū)域內(nèi)，如果某一點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的橫軸坐標(biāo)和縱軸坐標(biāo)所對(duì)應(yīng)的兩條序列的殘基相同，則在這個(gè)位置上打上標(biāo)記點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)通常都表示在一些小窗口中，序列相似性高于其它一些隔絕的區(qū)域（或者由DOTTER程序定義的隔絕區(qū)域，由不同的灰色陰影標(biāo)記）。如果兩個(gè)序列在一段區(qū)域內(nèi)很相似，標(biāo)記點(diǎn)將會(huì)連成一條斜線段，將這些線段的位置同圖7.3中兩個(gè)蛋白的已知的組成結(jié)構(gòu)相比較是很有價(jià)值的，特別是要注意連續(xù)反復(fù)出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域的出現(xiàn)方式。從PLAT的kringle結(jié)構(gòu)域開(kāi)始水平掃描，可以發(fā)現(xiàn)兩條線段對(duì)應(yīng)于F12序列中的兩個(gè)kringle結(jié)構(gòu)域，雖然現(xiàn)在我們已經(jīng)擁有許多更復(fù)雜更精確的方法來(lái)尋求局部相似性（下面將會(huì)討論），點(diǎn)陣描述方法仍然是一個(gè)很流行很有效的描述方法。
圖7.4、點(diǎn)陣序列比較：對(duì)人類凝血因子XII（F12：Swiss-Prot P00748）和組織血纖蛋白溶酶原活化因子（PLAT：Swiss-Prot P00750）的氨基酸序列進(jìn)行打點(diǎn)比較。這個(gè)圖由DOTTER程序（Sonnhammer ａnd durban,1996）產(chǎn)生。
在點(diǎn)陣描述方法中，某些形式的點(diǎn)可能會(huì)勾勒出一定的路徑，但這需要操作者通過(guò)這些信息進(jìn)行推理，另外一個(gè)圖形描述方法即路徑圖提供了更直接明了的比較結(jié)果，圖7.5描述了ＰＬＡＴ和ＰＬＡＵ中與ＥＧＦ相似的結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)行比較時(shí)的比對(duì)、點(diǎn)陣和路徑圖三種方法的關(guān)系。
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圖7.5、點(diǎn)陣、路徑圖和比對(duì)：所有這三種視圖都表示人類尿激酶血纖蛋白溶酶原活化因子（PLAU:Swiss-Prot P00749）和組織血纖蛋白溶酶原活化因子（PLAT:Swiss-Prot P00750）中同EGF相似的模塊的比對(duì)結(jié)果。a） .整個(gè)蛋白都由DOTTER程序進(jìn)行比較：這里只顯示了同EGF模塊相似的較小區(qū)域的放大圖；b）由BLASTP得到的比對(duì)的路徑圖；.c）.用普通的字符形式顯示的BLASTP空位比對(duì)。
要理解路徑圖，先想象一個(gè)二維格子，頂點(diǎn)表示序列殘基之間的點(diǎn)（與點(diǎn)陣中表示殘基本身相反），沿線段上連接兩個(gè)頂點(diǎn)的邊緣對(duì)應(yīng)兩個(gè)序列上匹配的殘基，水平和豎直線段的邊緣對(duì)應(yīng)一個(gè)序列擁有而另一個(gè)序列上沒(méi)有的殘基，換句話說(shuō)，這些邊緣平臺(tái)組成了比對(duì)中的空位，全圖對(duì)應(yīng)了所有可能的比對(duì)中必須審視的搜索空間，這個(gè)空間中每條可能的路徑都對(duì)應(yīng)于一種比對(duì)。 *佳比對(duì)方法 除了某些很不重要的問(wèn)題，對(duì)于眾多問(wèn)題而言，比對(duì)方法多種多樣，很有必要從中挑選出的一個(gè)或幾個(gè)方法，這就是把一種比對(duì)描述成一個(gè)路徑的概念所指。許多計(jì)算機(jī)科學(xué)的問(wèn)題都可以簡(jiǎn)化為通過(guò)圖表尋求*優(yōu)路徑（比如尋找從紐約打電話到舊金山的*有效的途徑）。為了這一目的已經(jīng)確立了許多行之有效的算法，對(duì)每一種路徑都有必要對(duì)其進(jìn)行某種意義上的打分，通常是對(duì)沿這一途徑的每一步的增量進(jìn)行加和。更精密的打分程序?qū)⒃谙挛臄⑹觯谶@里我們只假定相同殘基加正分，有插入或缺失的殘基就加負(fù)分（扣分），根據(jù)這一定義，*合適的比對(duì)方法會(huì)得到分，也就是我們尋找的*佳路徑。
今天我們所熟悉的Needleman-Wunsch算法就是針對(duì)尋求*佳序列比對(duì)這一問(wèn)題所設(shè)計(jì)的動(dòng)態(tài)規(guī)劃尋優(yōu)策略（Needleman ａnd Wunsch,1970）。動(dòng)態(tài)規(guī)劃的思想是這樣的，如果一條路徑終止于*佳路徑上的一點(diǎn)，那么這條路徑本身就是起點(diǎn)到這個(gè)中間點(diǎn)的*佳路徑，也就是說(shuō)，任何一個(gè)終止于*佳路徑上的一點(diǎn)的次級(jí)路徑必然就是終止于這一點(diǎn)的*佳路徑本身。這樣，*佳路徑就可以通過(guò)把各個(gè)*佳的次級(jí)路徑連接而成。在基本的Needleman-Wunsch公式表達(dá)中，*佳比對(duì)必然對(duì)每個(gè)序列都由始至終，就是說(shuō)從搜索空間的左上角直至右下角。換句話說(shuō),它搜索全程比對(duì)。
然而，對(duì)這種基本策略稍作修改就可以實(shí)現(xiàn)*佳的局部比對(duì)。這種比對(duì)的路徑不需要到達(dá)搜索圖的盡頭，只需要在內(nèi)部開(kāi)始和終結(jié)。如果某種比對(duì)的打分值不會(huì)因?yàn)樵黾踊驕p少比對(duì)隊(duì)的數(shù)量而增加時(shí)，這種比對(duì)就是*佳的。這個(gè)過(guò)程依賴于打分系統(tǒng)的性質(zhì)，就是說(shuō)某種路徑的打分會(huì)在不匹配的序列段位置減少（以下敘述的打分系統(tǒng)合乎這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)）。當(dāng)分值降為零時(shí)，路徑的延展將會(huì)終止，一個(gè)新的路徑就會(huì)應(yīng)運(yùn)而生。這樣，我們會(huì)得到許多獨(dú)立的路徑，它們以不匹配的序列段為界限而不是像在全程比對(duì)中以序列的結(jié)尾作為界限。在這些路徑中，擁有分的一個(gè)就是*佳的局部比對(duì)。
應(yīng)該意識(shí)到，尋優(yōu)方法總是把*佳的比對(duì)方法表達(dá)出來(lái)，而不在意它是否具有生物學(xué)意義，另一方面，尋求局部比對(duì)時(shí)可能會(huì)發(fā)現(xiàn)若干個(gè)重要的比對(duì)，因此，不能僅僅注意*佳的一個(gè)。改良的Smith-Waterman（Altschul ａnd Erickson,1986;Waterman ａnd Eggert,1987）算法把尋找K種的但不相互交叉的比對(duì)方式*為目標(biāo)，這些思想后來(lái)都在SIM算法（Huang et al.,1990）的發(fā)展中得以體現(xiàn)。一個(gè)名叫LALIGN（在FASTA程序包中）的程序提供了有用的SIM工具（Pearson,1996）。對(duì)于比對(duì)多模塊的蛋白質(zhì)而言，尋找次優(yōu)比對(duì)尤為重要。正如圖7.6所示，LALIGN程序被用來(lái)獲得三個(gè)的局部比對(duì)（比對(duì)人類凝血因子IX和因子XII）。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的Smith-waterman算法只會(huì)報(bào)告出的一個(gè)比對(duì)，改良的算法會(huì)報(bào)告出第二和第三的比對(duì)方式，從而顯示出功能結(jié)構(gòu)域。
Comparison of: using protein matrix ① 35.4% identity in 254 aa overlap; score: 358 220 230 240 250 260 270 F9 QSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVE－－-TGVKI .:....:::::: : .:. :. ..: ..::.::... :..:::::.. . .. F12 KSLSSMTRVVGGLVALRGAHPYIAALY-WGHSFCAGSLIAPCWVLTAAHCLQDRPAPEDL 370 380 390 400 410 420 280 290 300 310 320 330 F9 TVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPL－－－－-VLNSY ::: :... ... .. :. .: . :...... .:.::.::: :.: .:..: F12 TVVLGQERRNHSCEPCQTLAVRSYRLHEAFSPV－－SYQHDLALLRLQEDADGSCALLSPY 430 440 450 460 470 480 340 350 360 370 380 F9 VTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRS-ALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKF- : :.:... . .. :.:::. :. . . : :: .::... . : ..
F12 VQPVCLPSGAARPSETTLCQ—VAGWGHQFEGAEEYASFLQEAQVPFLSLERCSAPDVHG
490 500 510 520 530 390 400 410 420 430 440 F9 -TIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTS－－-FLTGIISWGEECAMKGKYGIY .: .:.:::: ::: :.:::::::: : : .... : ::::::..:. ..: :.: F12 SSILPGMLCAGFLEGGTDACQGDSGGPLVCEDQAAERRLTLQGIISWGSGCGDRNKPGVY 540 550 560 570 580 590 450 F9 TVVSRYVNWIKEKT :.:. :..::.:.: F12 TDVAYYLAWIREHT 600 610 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ② 34.7% identity in 49 aa overlap; score: 120 100 110 120 130 140 F9 VDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGR .....: .::::.::.: . . : :: :..: :..:.. . .:: F12 LASQACRTNPCLHGGRCLEVEGHRLCHCPVGYTGPFCDVDTKASCYDGR 180 190 200 210 220 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－- ③ 33.3% identity in 36 aa overlap; score: 87 100 110 120 F9 DQCESN-PCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFECKNCE :.:... :: .::.: . .. .: :: ..:..:. F12 DHCSKHSPCQKGGTCVNMPSGPHCLCPQHLTGNHCQ 100 110 120 130 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
圖7.6、*佳和次佳的局部比對(duì)：在使用LALIGN對(duì)人類凝血因子IX（F9;Swiss-Prot 900740）和凝血因子XII（F12;Swiss-Prot P00748）進(jìn)行比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)了三個(gè)*佳的比對(duì)結(jié)果。
取代分和空位處罰
剛才描述的打分系統(tǒng)僅僅使用于簡(jiǎn)單的匹配/不匹配的情況，但是在比較蛋白質(zhì)時(shí)，我們可以用取代矩陣來(lái)增強(qiáng)弱勢(shì)比對(duì)的敏感性。很顯然，在相關(guān)蛋白質(zhì)之間，某些氨基酸可以很容易地相互取代而不用改變它們的生理生化性質(zhì)，這些保守取代的例子包括異亮氨酸（isoleucine）和頡氨酸（valin）（體積小，疏水），絲氨酸（serine）和蘇氨酸（threonin）（極性）。在計(jì)算比對(duì)分之時(shí)，相同的氨基酸打分會(huì)高于取代的氨基酸，而保守的取代打分高于非保守變化，換句話說(shuō)，設(shè)計(jì)了一系列的分值，而且，在比對(duì)非常相近的序列（mouse和rat的同源基因）以及差異極大的序列（mouse和 yeast的基因）時(shí)會(huì)設(shè)計(jì)出不同系統(tǒng)的分值，考慮到這些因素，使用取代矩陣會(huì)極為有利，在這個(gè)矩陣中，任何氨基酸配對(duì)的分值會(huì)一目了然。
個(gè)廣泛使用的*優(yōu)矩陣建立在進(jìn)化的點(diǎn)突變模型上（PAM）（Dayhoff et al.,1978）。一個(gè)PAM就是一個(gè)進(jìn)化的變異單位即1%的氨基酸改變，這并不意味著經(jīng)過(guò)100次PAM后，每個(gè)氨基酸都發(fā)生變化，因?yàn)槠渲幸恍┪恢每赡軙?huì)經(jīng)過(guò)多次改變，甚至可能變回到原先的氨基酸，因此另外一些氨基酸可能不發(fā)生改變。如果這些變化是隨機(jī)的，那么每一種可能的取代頻率僅僅取決于不同氨基酸的出現(xiàn)的頻率（稱為背景頻率）。然而，在相關(guān)蛋白中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的取代頻率（稱為目標(biāo)頻率）大大地傾向于那些不影響蛋白質(zhì)功能的取代，換句話說(shuō)，這些點(diǎn)突變已經(jīng)被進(jìn)化所接受。Dayhoff同合作者們次使用了log-odd處理，在這種處理中，矩陣中的取代分值同目標(biāo)頻率于背景頻率的比值的自然對(duì)數(shù)成比例。為了評(píng)估目標(biāo)頻率，人們用非常相近的序列（比對(duì)時(shí)不需要取代矩陣）來(lái)收集對(duì)應(yīng)于一個(gè)PAM的突變頻率，然后將數(shù)據(jù)外推至250個(gè)PAM，PAM250矩陣結(jié)果如圖7.7。雖然Dayhoff等人只發(fā)表了PAM250，但潛在的突變數(shù)據(jù)可以外推至其它PAM值，產(chǎn)生一組矩陣，在比較差異極大的序列時(shí)，通常在較高的PAM值處得到*佳結(jié)果，比如在PAM200到250之間，較低值的PAM矩陣一般使用于高度相似的序列（Altschul,1991）。
圖7.7、PAM250分值矩陣。
用同樣方式建立了BLOSUM取代矩陣，但在評(píng)估目標(biāo)頻率時(shí)，應(yīng)用了不同的策略，基本數(shù)據(jù)來(lái)源于BLOCKS數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包括了局部多重比對(duì)（包含較遠(yuǎn)的相關(guān)序列，同在PAM中使用較近的相關(guān)序列相反）。雖然在這種情況下，沒(méi)有進(jìn)化模型，但它的優(yōu)點(diǎn)在于可以通過(guò)直接觀察獲得數(shù)據(jù)而不是通過(guò)外推獲得。同PAM模型一樣，也有許多編號(hào)的BLOSUM矩陣，這里的編號(hào)指的是序列可能相同的水平，并且同模型保持獨(dú)立性。舉例來(lái)說(shuō)，如圖7.8所示的BLOSUM的矩陣，至少有62%的相同比例的序列被組合成一個(gè)序列，因此取代頻率更加受到那些比空位變化還大的序列的極大影響，取代矩陣在處理高度相似序列時(shí)使用高的閾值（直至BLOSUM90），處理差異大的序列時(shí)使用低的閾值（直至BLOSUM30）。
圖7.8、BLOSUM62分值矩陣。
為了補(bǔ)償那些插入或缺失，可以在比對(duì)中引入一些空位，但不能太多，否則會(huì)使分子變得面目全非。每引入一個(gè)斷裂，比對(duì)的分值都會(huì)有所扣除，對(duì)于這些斷裂有許多罰分的規(guī)則。*常用的一個(gè)就是用一個(gè)附加的罰分比例去乘空位的長(zhǎng)度，其中有兩個(gè)參數(shù)：G（有時(shí)稱為斷裂開(kāi)放懲罰）和L（斷裂延伸懲罰），對(duì)于一個(gè)長(zhǎng)度為n的空位，扣分總數(shù)為G+Ln，但在選擇空位參數(shù)時(shí)，在很大程度上是唯經(jīng)驗(yàn)的，所選的分值很少會(huì)有理論上的支持。通常來(lái)說(shuō)，對(duì)于G會(huì)選擇一個(gè)高分（在BLOSUM62中約為10-15），對(duì)于L會(huì)選擇一個(gè)相對(duì)的低分（大約1-2），選擇這個(gè)范圍是因?yàn)椴迦牒妥儺愂呛芎币?jiàn)的，但當(dāng)它們一旦發(fā)生，就會(huì)影響到一系列附近的殘基。
比對(duì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性 對(duì)任何一個(gè)比隊(duì)，我們都可以計(jì)算一個(gè)分值，但重要的是需要判定這個(gè)分值是否足夠高，是否能夠提供進(jìn)化同源性的證據(jù)。在解決這一問(wèn)題時(shí)，對(duì)于偶然出現(xiàn)的分，有些思想很有幫助，但是，沒(méi)有一個(gè)數(shù)學(xué)理論能夠描述全程比對(duì)的分值分布，其中一個(gè)能評(píng)估其重要性的方法就是將所得的比對(duì)分值和那些同樣長(zhǎng)度和組成的隨機(jī)序列進(jìn)行比較。
但是，對(duì)于局部比對(duì)而言，情況要好得多。正如問(wèn)題總是從簡(jiǎn)單開(kāi)始，人們首先注意到那些沒(méi)有多少空位得局部比對(duì)，這種比對(duì)被稱為高分片段配對(duì)（HSP）。HSP通常用改進(jìn)得Smith-waterman算法或簡(jiǎn)單地使用大的空位罰分方法獲得。Karlin-Altschul統(tǒng)計(jì)學(xué)為描述隨機(jī)的HSP分值的分布提供了數(shù)學(xué)理論，概率密度函數(shù)形式被稱為極值分布，這很值得注意，因?yàn)�，更普遍更一般的分布的�?yīng)用可能會(huì)夸大它的重要性，把一個(gè)已知得比對(duì)分值S同預(yù)期的分布相關(guān)聯(lián)可能會(huì)計(jì)算出P值，從而給出這個(gè)分值的比對(duì)顯著性的可能性。通常，P值越趨近于零，分值越有意義。
相關(guān)的變量E表示分值不低于S得可能的比對(duì)數(shù)量，而極值分布由兩個(gè)參數(shù)表示，即K和λ，可以得到解析解，并且對(duì)于任何打分系統(tǒng)以及背景頻率都是固定的。比對(duì)的顯著性依賴于搜索空間的大�。ň拖裨诓荻阎姓裔樢蕾囉诓荻训拇笮。�。搜索空間的大小由序列長(zhǎng)度計(jì)算出來(lái)，但由于統(tǒng)計(jì)的正確性，這個(gè)長(zhǎng)度必須由局部比對(duì)的預(yù)期長(zhǎng)度進(jìn)行校正，以免出現(xiàn)邊緣效應(yīng)（Altschul ａnd Gish,1996），需要進(jìn)行這種校正還因?yàn)樵谒阉骺臻g邊緣開(kāi)始的比對(duì)在達(dá)到一個(gè)有效分值之前就會(huì)超出序列的范圍。
把比對(duì)局限于沒(méi)有空位的基礎(chǔ)之上，使問(wèn)題大大簡(jiǎn)化，但是卻脫離分子生物學(xué)的實(shí)際情況。實(shí)際上，要建立一個(gè)插入和缺失的精確模型需要空位，但如果空位相對(duì)較少，在這些空位之間仍然可以獲得高分值區(qū)域，有代表性的是可能會(huì)獲得緊密相鄰的HSP，在這種情況下，從總體上去評(píng)估它的顯著性是較為合理的，也許，每個(gè)片段并不顯得很重要，但是幾個(gè)片段同時(shí)出現(xiàn)就不太像是偶然事件了。Karlin-Altschul加和統(tǒng)計(jì)學(xué)可以計(jì)算N個(gè)HSP的統(tǒng)計(jì)值，這個(gè)方法的實(shí)質(zhì)是把N個(gè)*佳片段的分值進(jìn)行加總，從而計(jì)算事件偶然發(fā)生的可能性，其它一些論據(jù)也被用來(lái)確認(rèn)這些分值只是在片段與比對(duì)一致的情況下進(jìn)行加總。雖然加總的分值分布與HSP分值值有差異，仍然可以得到解析解。
*后，仍然有必要對(duì)局部排隊(duì)的顯著性進(jìn)行合理評(píng)估，其中包括了模型中的空位。正如同傳統(tǒng)的Smith-waterman比對(duì)，雖然沒(méi)有先驗(yàn)的證據(jù)，人們?nèi)匀徽J(rèn)為這些比對(duì)的分值也應(yīng)該遵循極值分布，但是，分布參數(shù)K和λ的值不能通過(guò)計(jì)算獲得，當(dāng)然，通過(guò)模型獲得這些值的方法已經(jīng)被大大地發(fā)展了。
數(shù)據(jù)庫(kù)中的相似性搜索
上述討論主要集中于那些較為特別的匹配的序列，但是對(duì)于一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的序列，我們無(wú)法得知用什么序列同它進(jìn)行比對(duì)，數(shù)據(jù)庫(kù)相似性搜索使我們能夠從數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的數(shù)十萬(wàn)個(gè)序列中挑選出可能同感興趣的序列有關(guān)聯(lián)的序列，這個(gè)方法有時(shí)會(huì)導(dǎo)致意想不到的收獲。用這種策略獲得成功的個(gè)例子是人們因此發(fā)現(xiàn)病毒腫瘤基因v-sis是細(xì)胞中編碼血小板派生生長(zhǎng)因子的基因的一個(gè)變體形式（Doolittle et al., 1983; Waterfield et al., 1983）。那個(gè)時(shí)候，序列數(shù)據(jù)庫(kù)還不大，因此這個(gè)發(fā)現(xiàn)足以另人感到萬(wàn)分驚奇。然而今天如果進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索并且一無(wú)所獲的話，那就更另人感到費(fèi)解了。如同其它幾個(gè)小的物種基因組一樣，酵母saccharomyces cerevisiae的基因組全序列已經(jīng)被測(cè)定出來(lái)。在脊椎動(dòng)物中，大量的部分基因諸如人類和老鼠的基因都已經(jīng)被測(cè)定并存入基因庫(kù)（genebank）中，這也導(dǎo)致了表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）工程。EST片段的主要用途是在數(shù)據(jù)庫(kù)搜索中，用EST片段進(jìn)行cDNA克隆可以分離出感興趣的基因，包括其它模型生物中的同源基因。*近報(bào)導(dǎo)的多重內(nèi)分泌腺腫瘤（MENI）基因就和人與老鼠的多個(gè)EST片段相匹配，其中在MENI發(fā)表前一年就已經(jīng)入庫(kù)保存了（Chandrasekharappa et al., 1997）。
在數(shù)據(jù)庫(kù)搜索中，基本操作就是將查詢序列和數(shù)據(jù)庫(kù)中的主題序列作比對(duì)。比對(duì)結(jié)果是排列好的hit list，后面是一系列的單獨(dú)的比對(duì)情況，以及不同的分值和統(tǒng)計(jì)值（如圖7.9）。下文將會(huì)詳細(xì)介紹選擇不同的搜索程序、序列數(shù)據(jù)庫(kù)和不同的參數(shù)都會(huì)對(duì)搜索產(chǎn)生影響，而且還有不同的界面，比如操作臺(tái)命令、WWW形式和E-mail等。圖7.10給出了一個(gè)使用Web界面進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的例子。這種形式的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是對(duì)任何一個(gè)感興趣的比對(duì)，全部注解和文獻(xiàn)應(yīng)用都可以通過(guò)超文本簡(jiǎn)單方便地聯(lián)接至原始的序列條目和相關(guān)的在線文獻(xiàn)。
a
The best score are: initn initl opt z-sc E（59248）
gi|1706794|sp|P49789|FHIT_HUMAN FRAGILE HISTIDINE 996 996 996 1350.4 0
gi|1703339|sp|P49776|APH1_SCHPO BIS（5’-NUCLEOSYL） 431 395 395 536.2 2.8e-23
gi|1723425|sp|P49775|YD15_YEAST HYPOTHETICAL 24.8 290 171 316 428.1 2.9e-17 gi|1724021|sp|Q11066|YHIT_MYCTU HYPOTHETICAL 20.0 178 178 184 250.7 2.2e-07 gi|417124|sp|Q04344|HIT_YEAST HIT1 PROTEIN （ORF U 159 104 157 216.2 1.8e-05 gi|418447|sp|P32084|YHIT_SYNP7 HYPOTHETICAL 12.4 139 139 140 195.0 0.00028 gi|1351828|sp|P47378|YHIT_MYCGE HYPOTHETICAL 15.6 132 132 133 183.9 0.0012 à gi|1169826|sp|P43424|GAL7_RAT GALACTOSE-1-PHOSPHA 97 97 128 169.7 0.0072 gi|418446|sp|P32083|YHIT_MYCHR HYYPOTHETICAL 13.1 102 102 119 166.8 0.01 gi|1708543|sp|P49773|IPK1_HUMAN PROTEIN KINASE C 87 87 118 164.5 0.0014 gi|1724020|sp|P49774|YHIT_MYCLE HYPOTHETICAL 17.0 131 82 117 161.5 0.02 gi|1724019|sp|P53795|YHIT_CAEEL HYPOTHETICAL HIT- 98 98 116 161.5 0.02 gi|1170581|sp|P16436|IPK1_BOVIN PROTEIN KINASE C 86 86 115 160.4 0.023 gi|1730188|sp|Q03249|GAL7_MOUSE GALACTOSE-1-PHOSP 87 87 120 159.3 0.027 gi|1177047|sp|P42856|ZB14_MAIZE 14 KD ZINC-BIODIN 132 79 112 156.3 0.04 gi|1209081|sp|P07902|GAL7_HUMAN CALACTOSE-1-PHOSPH 78 78 117 154.8 0.048 gi|1177046|sp|P42855|ZB14_BRAJU 14 KD ZINC-BINDIN 115 76 110 154.5 0.05 gi|140775|sp|P26724|YHIT_AZOBR HYPOTHETICAL 13.2 115 65 109 152.6 0.064 gi|1169852|sp|P31764|GAL7_HAEIN GALACTOSE-1-PHOSP 62 62 104 137.9 0.42
gi|113999|sp|P16550|APA1_YEAST 5’,5’’’-P-1,P-4-TE 108 66 103 137.1 0.47
b >>gi|1169826|sp|P43424|GAL7_RAT GALACTOSE-1-PHOSPHATE UR （379 aa） initn: 97 init1: 97 opt: 128 z-score: 169.7 E（）: 0.0072 Smith-Waterman score: 128; 30.8% identity in 107 aa overlap 10 20 30 FHIT MSFRFG-QHLIKPSVVFLKTELSFALVNRKPV ...: X.:.. . : .: ..:: : GAL7 VWASNFLPDIAQREERSQQTYHNQHGKPLLLEYGHQELLRKERLVLTSEYWIVLVPFWAV 190 200 210 220 230 240 40 50 60 70 80
FHIT VPGHVLVCPLRPVERFHDLRPDEVADLFQTTQRVGTVVEKHFHGTSLTFSM—QDGP－－-
: ..:. : : :.:. .: : : :: .: ... : .. X. ::. .:: . .: GAL7 WPFQTLLLPRRHVQRLPELTPAERDDLASTMKKLLTKYDNLFE-TSFPYSMGWHGAPMGL 250 260 270 280 290 300 90 100 110 120 130 140 FHIT EAGQTVKH－－VHVHVLPRKAGDFHRNDSIYEELQKHDKEDFPASWRSEEEMAAEAAALRV ..: : : .:.: : GAL7 KTGATCDHWQLHAHYYPPLLRSATVRKFMVGYEMLAQAQRDLTPEQAAERLRVLPEVHYC 310 320 330 340 350 360
圖7.9：進(jìn)行FASTA搜索的輸出：（a）用人類組氨酸三聯(lián)體蛋白作為（Swiss-Prot P.49789）查詢序列，以Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，進(jìn)行FASTA搜索所得到的命中結(jié)果，在這個(gè)操作中，參數(shù)ktup=1；（b）.以數(shù)據(jù)庫(kù)中的一個(gè)條款（在命中列表中以箭頭標(biāo)出）為查詢序列（其中包含老鼠的1-磷酸-半乳糖尿苷酸轉(zhuǎn)移酶序列）所得到的*佳局部比對(duì)結(jié)果。雖然在這里，序列的相似性不太好，但是這些蛋白在結(jié)構(gòu)上都顯示了很好的相似性。
7.10：在WWW上進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)相似性搜索：NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的高級(jí)BLAST形式，在Web網(wǎng)頁(yè)上容易實(shí)現(xiàn)。查詢序列應(yīng)該由剪切板中粘貼到的文本框中，（在本圖中，框中顯示的是U43746序列）。搜索中另外一些基本的元素包括搜索程序的名字以及數(shù)據(jù)庫(kù)的名字，這兩個(gè)元素都可以通過(guò)下拉框選擇。如果需要的話，可以設(shè)定附加的選項(xiàng)參數(shù)。這里還有一個(gè)基本的BLAST形式，當(dāng)然高級(jí)的選項(xiàng)參數(shù)被隱藏起來(lái)了。*后，簡(jiǎn)單地點(diǎn)擊一下“Submit”鍵，提交請(qǐng)求后就可以開(kāi)始搜索了。 如今的序列數(shù)據(jù)庫(kù)非常之大，并且正以爆炸式的速度不斷增長(zhǎng)，在這種條件下，利用動(dòng)態(tài)程序的方法直接進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索已經(jīng)變得不切實(shí)際。一個(gè)解決方法就是使用大型計(jì)算機(jī)和相關(guān)的特殊硬件，但是我們要討論的目的是普通計(jì)算機(jī)能干些什么。當(dāng)*佳方法不可行時(shí)，我們必須求助于那些啟發(fā)式方法，這些方法充分利用了近似值以加快序列比較，但同時(shí)會(huì)在錯(cuò)過(guò)正確比對(duì)這一方面冒一點(diǎn)險(xiǎn)。
有一種啟發(fā)式方法建立在這樣的策略之上，它將序列分解成由連續(xù)字母組成的短串（稱為字串）。基于字的方法，在八十年代早期由Wilbur和Lipman提出，并且廣泛使用于今天的搜索程序之中。其基本思想是這樣的，一個(gè)能夠揭示出正確的序列關(guān)系的比對(duì)至少包含一個(gè)兩個(gè)序列都擁有的字串，把查詢序列中的所有字串編成索引，并且在數(shù)據(jù)庫(kù)掃描中查詢這些索引，這些擊中的字串就會(huì)很快被鑒定出來(lái)。
FASTA
FASTA程序是個(gè)廣泛使用的數(shù)據(jù)庫(kù)相似性搜索程序。為了達(dá)到較高的敏感程度，程序引用取代矩陣實(shí)行局部比對(duì)以獲得*佳搜索。但眾所周知，使用這種策略會(huì)非常耗費(fèi)工作時(shí)，為了提高速度，在實(shí)施耗時(shí)的*佳搜索之前，程序使用已知的字串檢索出可能的匹配。在速度和敏感度之間權(quán)衡選擇依賴于ktup參數(shù)，它決定了字串的大小。增大ktup參數(shù)就會(huì)減少字串命中的數(shù)目，也就會(huì)減少所需要的*佳搜索的數(shù)目，提高搜索速度。缺省的ktup值在進(jìn)行蛋白比較時(shí)選擇2，但是在間距較大的情況下，將ktup值降為1較為理想。
FASTA程序并不會(huì)研究每一個(gè)遇到的字串命中，但在一開(kāi)始會(huì)尋找包含若干個(gè)附近的命中的片段。使用啟發(fā)式方法，這些片段會(huì)被賦予分值，的一個(gè)在輸出時(shí)會(huì)顯示為init1分值，這若干個(gè)片段會(huì)被組合起來(lái)，一個(gè)新的initn分值會(huì)從中計(jì)算出來(lái)。然后在的初始片段中局限于其對(duì)角線帶上，會(huì)進(jìn)行一次包含空位的局部比對(duì)以評(píng)估*可能的匹配。這個(gè)*佳比對(duì)的分值會(huì)在輸出時(shí)顯示為opt分值。對(duì)*后報(bào)導(dǎo)的比對(duì)來(lái)說(shuō)，還要進(jìn)行一次全程的Smith-Waterman比對(duì)。圖7.9b顯示了一個(gè)例子。對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的每一個(gè)序列都只會(huì)由一個(gè)*佳的比對(duì)，但是，如果蛋白質(zhì)中包含若干個(gè)模塊，一些很有意義的比對(duì)就會(huì)被錯(cuò)過(guò)，匹配序列還必須由LALIGN程序作進(jìn)一步分析。
從2.0版本開(kāi)始，FASTA對(duì)每一個(gè)檢索到的比對(duì)都提供一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的評(píng)估。程序?yàn)殡S機(jī)分值假定了一個(gè)極值分布，但是改寫(xiě)了概率密度函數(shù)的形式，其中預(yù)期的分值與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列長(zhǎng)度的自然對(duì)數(shù)呈線形關(guān)系，這樣，可以使用簡(jiǎn)單的線形回歸函數(shù)計(jì)算常規(guī)的比對(duì)的z值。*后，計(jì)算出預(yù)期的E值，從而給出那些z值不小于已知值的隨機(jī)比對(duì)的預(yù)期數(shù)目。
BLAST
BLAST程序?qū)?shù)據(jù)庫(kù)搜索進(jìn)行了大量的改良，提高了搜索速度，同時(shí)把數(shù)據(jù)庫(kù)搜索建立在了嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)之上。但是，為了達(dá)到這一目的，仍然需要權(quán)衡選擇，也就是說(shuō)，局部比對(duì)的限制條件可能不包括空位。這個(gè)限制條件對(duì)應(yīng)用Karlin-Altschul統(tǒng)計(jì)學(xué)極為有利，另一方面，既然空位沒(méi)有明確地放在模型中，結(jié)果就不會(huì)象人們期望的那樣接近于預(yù)期的比對(duì)。這并不是說(shuō)插入和確實(shí)會(huì)妨礙匹配，在大多數(shù)情況下，比對(duì)僅僅會(huì)被分解為若干個(gè)明顯的HSPs。無(wú)論如何，老版本的BLAST程序（1.4以前）的局限性在新版本中已經(jīng)被消除了，新版本在對(duì)待空位問(wèn)題上有著明確的作法（在下面討論）。
對(duì)于一個(gè)即將被BLAST程序報(bào)告的比對(duì)，其中必然包含一個(gè)HSP，其分值不小于終止值S。這個(gè)終止值因人而異，但是使用時(shí)是很難知道其合適值的。因?yàn)槌绦蚧?/font>Karlin-Altschul統(tǒng)計(jì)學(xué)，人們可以指明一個(gè)預(yù)期的終止E值，然后軟件會(huì)在考慮搜索背景的性質(zhì)的基礎(chǔ)上（比如數(shù)據(jù)庫(kù)的大小，取代矩陣的性質(zhì)）計(jì)算出正確的S值。BLAST的一項(xiàng)創(chuàng)新就是鄰近字串的思想。這個(gè)協(xié)定不需要字串確切地匹配，在引入取代矩陣的情況下，當(dāng)主題序列中的字串有一個(gè)分值T時(shí)，BLAST就宣布找到了一個(gè)命中的字串。這個(gè)策略允許較長(zhǎng)字串長(zhǎng)度（W）（為了提高速度），而忽略了敏感度。于是，T值稱為制衡速度和敏感度的臨界參數(shù)，而W是很少會(huì)變化的。如果T值增大，可能的命中字串的數(shù)目就會(huì)下降，程序執(zhí)行就會(huì)加快，減小T值會(huì)發(fā)現(xiàn)較遠(yuǎn)的關(guān)系。
發(fā)生一個(gè)字串命中后，程序會(huì)進(jìn)行沒(méi)有空位的局部尋優(yōu)，比對(duì)的分值是S。將比對(duì)同時(shí)向左方和右方延伸并將分值加和就會(huì)得到結(jié)果。當(dāng)遭遇一系列的分值時(shí)，加和的分值就會(huì)下降，這時(shí)，分值就不再可能反彈回S值。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為附加的啟發(fā)式知識(shí)提供了依據(jù)，因此，當(dāng)分值的降低（與遭遇的值相比）超過(guò)分值下降閾值X時(shí)，命中的延伸就會(huì)終止。于是，系統(tǒng)回減少毫無(wú)指望的命中延伸，繼續(xù)進(jìn)行其它操作。
使用BLAST
可以通過(guò)e-Mail、WWW或控制臺(tái)命令操作BLAST程序，無(wú)論如何，一次數(shù)據(jù)庫(kù)搜索包括四種基本元素：BLAST程序的名稱，數(shù)據(jù)庫(kù)名稱，查詢序列和大量的合適的參數(shù)，很顯然，當(dāng)以上元素發(fā)生變化時(shí)，搜索的細(xì)節(jié)就會(huì)隨之改變。為了避免混淆，我們把BLAST功能性描述為普通名詞，避免提及專有工具。讀者可能會(huì)要參考使用到的專有工具的有關(guān)內(nèi)容。要得到關(guān)于用e-Mail執(zhí)行BLAST搜索的介紹，給blast@ncbi.nlm.nih.gov發(fā)一封含有“HELP”的郵件；在WWW工具中，幫助是在線的；如果使用Unix系統(tǒng)，使用man blast可以獲得詳細(xì)的幫助信息。
表7.1、BLAST程序：
| 程序 | 數(shù)據(jù)庫(kù) | 查詢 | 內(nèi)容 |
| Blastp | 蛋白質(zhì) | 蛋白質(zhì) | 使用取代矩陣尋找較遠(yuǎn)的關(guān)系：可以進(jìn)行SEG過(guò)濾。 |
| Blastn | 核苷酸 | 核苷酸 | 尋找較高分值的匹配，對(duì)較遠(yuǎn)關(guān)系不太適用。 |
| Blastx | 核苷酸（翻譯） | 蛋白質(zhì) | 對(duì)于新的DNA序列和ESTs的分析極為有用。 |
| Tblastn | 蛋白質(zhì) | 核苷酸（翻譯） | 對(duì)于尋找數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有標(biāo)注的編碼區(qū)極為有用。 |
| tblastx | 核苷酸（翻譯） | 核苷酸（翻譯） | 對(duì)于分析EST極為有用。 |
幾種不同的BLAST可以通過(guò)查詢序列和數(shù)據(jù)庫(kù)序列的類型來(lái)加以區(qū)分：blastp比較的是查詢蛋白同蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)；相應(yīng)于核酸序列的程序是blastn；如果序列類型不同，DNA序列可以被翻譯成蛋白序列（所有六種閱讀框架）后同蛋白序列進(jìn)行比較，blastx比較一個(gè)DNA的查詢序列同一個(gè)蛋白質(zhì)序列庫(kù)，其結(jié)果對(duì)分析新序列和ESTs很有用；對(duì)于一個(gè)基于核酸序列庫(kù)的蛋白質(zhì)查詢，tblastn程序?qū)τ趯ふ覕?shù)據(jù)庫(kù)中序列的新的編碼區(qū)很有用；*后一個(gè)只在特殊情況下使用（在這里介紹只是出于完整的考慮），tblastx將DNA查詢序列和核酸序列庫(kù)中的序列全部翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比較，這個(gè)程序主要應(yīng)用于ESTs比較，尤其是當(dāng)人們懷疑到其中有可能的編碼區(qū)，即使并沒(méi)有確切地發(fā)現(xiàn)這一區(qū)域。
所有這些程序使用服務(wù)器上的序列數(shù)據(jù)庫(kù)，從而不需要本地的數(shù)據(jù)庫(kù)，表7.2和7.3陳列了一些BLAST使用的蛋白質(zhì)和核酸的序列數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)于常規(guī)的搜索，nr數(shù)據(jù)庫(kù)擁有大量的氨基酸和核酸序列，同時(shí)合并相同的序列以減少冗余度。為了檢測(cè)在過(guò)去30天里提出或更新的序列，提供了一個(gè)稱為“month”的數(shù)據(jù)庫(kù)。不管是nr還是month，都是日日更新。表7.2和7.3中列出的其它一些數(shù)據(jù)庫(kù)在一些特別的環(huán)境里十分有用，比如在比較模型物種（酵母和大腸桿菌）的全序列時(shí)，搜索特別類型的序列（dbest或dbsts），或檢測(cè)是否存在污染或問(wèn)題序列（vector，alu或mito）。
表7.2、使用BLAST的蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)：
| 數(shù)據(jù)庫(kù) | 描述 |
| Nr | 融合了Swiss-Prot,PIR,PRF以及從GenBank序列編碼區(qū)中得到的蛋白質(zhì)和PDB中擁有原子坐標(biāo)的蛋白質(zhì)，絕非多余。 |
| Month | Nr的字集，每月（30天）更新，搜集了過(guò)去30天中的*新序列。 |
| Swissprot | Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)。 |
| Pdb | 擁有三維空間結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)的氨基酸序列庫(kù)。 |
| Yeast | 由酵母基因組中基因編碼的全套蛋白質(zhì)。 |
| ecoli | 有大腸桿菌基因組中基因編碼的全套蛋白質(zhì)。 |
表7.3、使用BLAST的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)：
| 數(shù)據(jù)庫(kù) | 描述 |
| Nr | 極有價(jià)值的GenBank，排除了EST，STS和GSS部分。 |
| Month | Nr的字集，每月（30天）更新，搜集了過(guò)去30天中的*新序列。 |
| Est | Genbank中的EST部分（expressed sequence tags, 表達(dá)序列標(biāo)簽）。 |
| Sts | Genbank中的STS部分 （sequence tagged sites， 序列標(biāo)簽位點(diǎn)）。 |
| Htgs | Genbank中的HTG部分 （high throughput genomic sequences， 高容量基因組序列）。 |
| Gss | GenbankGSS（genome survey sequences，基因組測(cè)定序列）。 |
| Yeast | 酵母的全基因組序列。 |
| Ecoli | 大腸桿菌的全基因組序列。 |
| Mito | 脊椎動(dòng)物線粒體的全基因組序列。 |
| Alu | 搜集了靈長(zhǎng)類動(dòng)物的Alu重復(fù)序列。 |
| vector | 搜集了流行的帶菌體的克隆。 |
一個(gè)BLAST搜索的例子會(huì)介紹搜索輸出的不同元素。如圖7.11所示的例子，一種Alzheimer疾病感受性蛋白質(zhì)的氨基酸序列（由GenBank中L43964翻譯）作為查詢序列同dbest數(shù)據(jù)庫(kù)用tblastn進(jìn)行搜索。進(jìn)行這么一次搜索的目的是要鑒定模型生物中可能的同源物的cDNA克隆，從而為在人類中無(wú)法進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)打開(kāi)方便之門(mén)（相應(yīng)于EST序列的克隆是已經(jīng)實(shí)現(xiàn)的）。數(shù)據(jù)庫(kù)中的每一個(gè)EST序列在同alzheimer蛋白質(zhì)序列比較以前，都已經(jīng)按照所有的閱讀框架得到翻譯。圖7.11a顯示了此次搜索得到部分命中的列表，前兩列給出了每一個(gè)顯著性匹配的序列的標(biāo)識(shí)和描述。盡管瀏覽時(shí)定義被縮短了，我們?nèi)匀豢梢钥吹嚼鲜蠛凸壍男蛄卸急话M(jìn)來(lái)了。下一列給出了得到*佳HSP（即使其它閱讀框架翻譯結(jié)果也會(huì)達(dá)到命中）的閱讀框架。后面三列給出了*佳HSP的分值、p值總和及p值計(jì)算時(shí)使用到的HSP數(shù)目。
包含一種果蠅EST（由箭頭標(biāo)出）的比對(duì)在圖7.11b中得以顯示。其中包含了兩個(gè)HSP，并且顯示了每一個(gè)的分值，EST的概念性翻譯同查詢序列并排顯示。相同的氨基酸殘基在兩個(gè)序列之間回顯，+表示兩個(gè)不同殘基匹配的分值是正數(shù)（比如保守取代）。從不同閱讀框架得到的兩個(gè)HSP是顯著的并且彼此相鄰，這一點(diǎn)從序列坐標(biāo)就可以看出來(lái)。這種形式表示EST序列的一種閱讀框架是錯(cuò)誤的，并且對(duì)于用相對(duì)容錯(cuò)性的工具進(jìn)行序列單向通行數(shù)據(jù)分析時(shí)極為有效。
a
sum
Reading High Probability Y
sequence producing High-scoring Segment Pairs: Frame Score P（N） N
gb|AA056325|AA056325 zf53a03.sl Soarea retina N2b4HR H... +3 724 3.4e-102 2
gb|T03796|T03796 IBIB913 Infant brain,Bento Soares...+3 567 2.6e-78 2
gb|AA260597|AA260597 mx76g09.r1 Soares mouse NML Mus m...+2 239 4.9e-53 4
gb|H86456|H86456 yt01b06.s1 Homo sapiens cDNA clon...+2 323 4.3e-52 4
gb|N24576|N24576 yx72a04.s1 Homo sapiens cDNA clon...+1 365 5.5e-47 2
gb|AA265273|AA265273 mx91c12.r1 Soares mouse NML Mus m...+2 239 6.4e-41 2
gb|AA237206|AA237206 mx18e01.r1 Soares mouse NML Mus m...+3 159 1.5e-40 3
gb|R146001|R146001 yf34b10.r1 Homo sapiens cDNA clon...+1 278 1.5e-40 2
gb|AA200706|AA200706 mu03f12.r1 Soares mouse 3NbMs Mus...+1 343 1.9e-40 1
gb|AA045064|AA045064 zk77f12.s1 Soares pregnant ulerus...-3 269 2.3e-37 2
gb|AA087434|AA087434 mm28a04.r1 Stratagene mouse skin....+3 322 3.6e-37 1
gb|R05907|R05907 ye93h02.r1 Homo sapiens cDNA clon...+3 252 7.7e-37 2
gb|AA268820|AA268820 vb01c10.r1 Soares mouse NML Mus m...+2 234 7.7e-35 2
gb|AA162310|AA162310 mn44a07.r1 Beddington mouse embry...+1 134 8.3e-34 3
gb|N27820|N27820 yx54h10.r1 Homo sapiens cDNA clon...+3 154 7.8e-29 2
gb|AA234907|AA234907 zs38f03.r1 Soares NhHMPu S1 Homo... +2 155 1.8e-28 2
gb|AA231081|AA231081 mw11d11.r1 Soares mouse 3NME12 5... +3 134 8.8e-23 2
gb|H91652|H91652 ys80c04.s1 Homo sapiens cDNA clon... -3 215 3.7e-22 1
gb|H50532|H50532 yo30h08.s1 Homo sapiens cDNA clon... -2 211 1.2e-21 1
gb|AA150236|AA150236 zl03c01.r1 Soares pregnant uterus...+1 159 5.0e-21 2
gb|AA144382|AA144382 mr15d12.r1 Soares mouse 3NbMS Mus...+3 159 7.6e-21 2
à gb|AA390557|AA390557 LD09473.5prime LD Drosophila Embr...+3 130 1.6e-20 2
gb|AA210480|AA210480 mo86b03.r1 Beddington mouse embry...+2 128 2.0e-20 3
gb|H19021|H19021 ym44b02.r1 Homo sapeins cDNA clon...+2 134 5.9e-20 2
gb|AA283084|AA283084 zt14g09.s1 Soares NbHTGBC Homo sa...-3 175 2.3e-19 2
gb|H25759|H25795 y149d01.s1 Homo sapiens cDNA clon...-2 185 5.0e-18 1
gb|H33787|H33787 EST110123 Rattus sp.cDNA 5’ end..... +1 137 6.7e-17 2
gb|AA201988|AA201988 LD05058.5prime LD Drosophila Embr...+3 175 5.5e-15 1
gb|AA263526|AA263526 LD06652.5prime LD Drosophila Embr...+1 167 7.0e-14 1
gb|R46340|R46340 yj52c04.sl Homo sapiens cDNA clon...-1 151 5.6e-13 1
gb|AA246675|AA246675 LD05588.5prime LD Drosophila Embr...+2 117 2.8e-10 2
gb|AA282899|AA282899 zt14g09.r1 Soares NbHTGBC Homo sa...+3 118 6.1e-07 1
gb|AA247705|AA247705 csh0941.seq.F Human fetal heart,....+3 56 0.0039 2
b
gb|AA390557|AA390557 LD09473.5prime LD Drosophila Embryo Drosophila
melanogaster cDNA clone LD09473 5’
Length – 659
Score – 130 （60.4 bits）, Expect – 1.6e-20, Sum P（2） – 1.6e-20
Identities – 25/60 （41%）, Positives – 40/60 （66%）, Frame - +3
Query: 105 TIKSVRFYTEKNGQLIYTTFTEDTPSVGQRLLNSVLNTLIMISVIVVMTIFLVVLYKYRC 164
+I S+ FY + L+YT F E +P + +++ ++LI++SV+VVMT L+VLYK RC
sbjct: 480 SINSISFYNSTDVYLLYTPFHEQSPEPSVKFWSALGSSLILMSVVVVMTFLLIVLYKKRC 659
Score – 117 （54.3 bits）, Expect – 1.6e-20, Sum P（2） – 1.6e-20
Identities –23/30 （76%）, Positives – 27/30 （90%）, Frame - +1
Query: 75 LEEELTLKYGAKHVIMLFVPVTLCMIVVVA 104
+EEE LKYGA+HVI LFVPV+LCM+VVVA
sbjct: 391 MEEEQGLKYGAQHVIKLFVPVSLCMLVVVA 480
圖7.11、一次TBLASTN搜索的輸出：在這次TBLASTN搜索中，以dbest數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，以阿爾茨海默氏�。催M(jìn)行性老年性癡呆）基因（Genbank 檢索號(hào)碼L43964）的蛋白質(zhì)產(chǎn)物為查詢序列，目的是為了從其它那些可能同人類基因有同源性的物種中鑒定出一些cDNA克隆。（a）.命中列表的一部分顯示了其中的25個(gè)命中。每個(gè)檢索出來(lái)的序列都由它們的GenBank檢索號(hào)碼以及一部分定義行組成。其中包括了它們的閱讀框架和*佳HSP分值，同時(shí)顯示的還有一個(gè)偶然命中的可能性的加和。*后一列中的數(shù)據(jù)給出了在計(jì)算加和的可能性時(shí)所涉及到的HSP的數(shù)量。在這個(gè)命中列表中可以見(jiàn)到至少10條從老鼠中得到的序列和一條從果蠅中得到的序列； （b）.同果蠅的EST序列（GenBank AA390557）理論上的翻譯序列匹配的結(jié)果。找到了兩個(gè)HSPs，每一個(gè)使用不同的閱讀框架。相同的殘基在兩行序列中間的相應(yīng)位置回顯，而“+”符號(hào)標(biāo)記著那些不相同但是其取代分值是正分的殘基。
BLAST的*新改進(jìn)
*近發(fā)布的BLAST程序的修訂版提高了搜索速度、敏感度和實(shí)用性。這個(gè)完全重新寫(xiě)過(guò)的軟件包指定為2.0版本（避免同WU-BLUST混淆，這個(gè)軟件是由華盛頓大學(xué)設(shè)計(jì)的，有時(shí)稱為BLAST2）。應(yīng)該注意到，在發(fā)布的2.0版本中，命令行的參數(shù)有很大改變，其中一些常用的參數(shù)列在表7.4中。
一個(gè)改進(jìn)來(lái)自于引發(fā)一個(gè)字串命中的延伸的標(biāo)準(zhǔn)�，F(xiàn)在，在一個(gè)需要考慮的殘基的窗口里必須找到兩個(gè)字串命中。使用這種策略提高了搜索速度，因?yàn)榇罅侩S機(jī)的字串命中將會(huì)被忽略，并且很有可能得到一個(gè)顯著性良好的比對(duì)。第二個(gè)改進(jìn)是能夠明確地而不是含蓄地處理空位。除了幫助使用者更加容易地理解產(chǎn)生的比對(duì)，新版本還提高了較遠(yuǎn)關(guān)系的敏感性，其中可能會(huì)包含許多插入和缺失。比較從尋找無(wú)空位的HSP這一標(biāo)準(zhǔn)策略開(kāi)始，然后，這一比對(duì)中獲得分區(qū)域的中心一列被鑒定出來(lái)，接著，從這一點(diǎn)向前和向后延伸，通過(guò)賦值的路徑進(jìn)行無(wú)空位局部比對(duì)的搜索。如同*初的HSP搜索，一個(gè)分值下降的閾值X將會(huì)促使放棄那些遭遇大量負(fù)的取代分值的路徑。對(duì)剩余的HSP進(jìn)行反復(fù)的這種操作，將會(huì)揭示另外的含空位的比對(duì)，并保證它們同已經(jīng)報(bào)告的部分不會(huì)相交。這個(gè)系統(tǒng)不同于FASTA所采取的策略，FASTA只會(huì)產(chǎn)生一個(gè)*佳的比對(duì)。
表7.4、一些對(duì)于BLAST很有用的參數(shù)值：
| 參數(shù)名稱 | BLAST 1.4 | BLAST 2.0 |
| 數(shù)據(jù)庫(kù) （database） | 參數(shù) | -d database |
| 查詢序列文件 （query sequence file） | 第二參數(shù) | -I filename |
| 期望閾值E （expectation cutoff） | E = number | -e number |
| HSP分值閾值S （HSP score cutoff） | S = number | -s number |
| 字串分值閾值T （word score cutoff） | T = number | -f number |
| 多命中窗口A （multihit window） | n/a | -A number |
| 打分矩陣 （score matrix） | -matrix matrix | -M matrix |
| 低復(fù)雜度過(guò)濾 （low-complexity filtering） | -filter seg | -F |
| 空位開(kāi)放罰分 （gap opening penalty） | n/a | -G number |
| 空位拓展罰分 （gap extension penalty） | n/a | -E number |
| PSI-BLAST反復(fù) （PSI-BLAST iterations） | n/a | -j number |
對(duì)于那些弱勢(shì)的但是顯著性較強(qiáng)的比對(duì)，進(jìn)行較高敏感性的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的一個(gè)方法就是使用諸如profile（表頭輪廓）的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)（Gonzalez et al., 1994）。這個(gè)策略可能曾經(jīng)被認(rèn)為是個(gè)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的比較的課題，但是BLAST的一個(gè)新特性簡(jiǎn)化了基于profile的搜索工作。一個(gè)profile可能會(huì)被理解為一個(gè)列表，其中列出了在一個(gè)保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中每一個(gè)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)每一種氨基酸殘基的頻率。建立一個(gè)profile可能是很乏味的，其信息是從那些擁有我們感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)中得到的，這些比對(duì)必須預(yù)先準(zhǔn)備好，而且，在這里有許多技術(shù)上的問(wèn)題還沒(méi)有解決。
位點(diǎn)特性反復(fù)BLAST（PSI-BLAST）是指BLAST2.0的一個(gè)特性，其中一個(gè)profile被不斷組織并且不斷精練。這個(gè)過(guò)程開(kāi)始于使用一個(gè)簡(jiǎn)單查詢序列的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。在這個(gè)初始的搜索結(jié)果中，一個(gè)profile從高度顯著的比對(duì)中獲得，然后這個(gè)profile在第二輪的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索中使用。如果需要的話，這個(gè)過(guò)程會(huì)反復(fù)進(jìn)行，并且在操作中為了精練profile，會(huì)在每一輪中加入新的序列。
為了演示PSI-BLAST方法的高敏感性，旦氨酸三聯(lián)體蛋白（HIT）序列被用來(lái)作為數(shù)據(jù)庫(kù)搜索中的查詢序列。HIT和1-磷酸乳糖尿苷酸轉(zhuǎn)移酶（GalT）基于位點(diǎn)重疊的三位結(jié)構(gòu)相似性*近得到描述（Holm ａnd Sander, 1997）。經(jīng)過(guò)一次標(biāo)準(zhǔn)的（一輪）BLASTP搜索，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一個(gè)對(duì)GalT序列有顯著的命中。但是經(jīng)過(guò)多次搜索，在每一次反復(fù)中都發(fā)現(xiàn)新的關(guān)系，正如圖7.12所示。在第二次搜索中了發(fā)現(xiàn)老鼠的GalT蛋白質(zhì)，并且在這一信息被加入profile之后，另外一些其它物種的同源物也被檢測(cè)出來(lái)。
Sequences producing significant alignments: Hign E
Score Value
Pass1:
sp|P49789|FHIT_HUMAN FRAGILE HISTIDINE TRIAD PROTEIN 290 7e-79
sp|P49776|APH1_SCHPO BIS（5’ – NUCLEOSYL） – TETRAPHOSPHATASE （ASYMME... 117 8e-27
sp|P49775|YD15_YEAST HYPOTHETICAL 24.8 KD HIT – LIKE PROTEIN 88.0 6e-18
sp|Q11066|YHIT_MYCTU HYPOTHETICAL 20.0 KD HIT – LIKE PROTEIN 52.7 3e-07
sp|Q04344|HIT_YEAST HIT1 PROTEIN （ORF U） 45.3 4e-05
Pass2:
sp|P47378|YHIT_MYCGE HYPOTHETICAL 15.6 KD HIT – LIKE PROTEIN 70.5 1e-12
sp|P32083|YHIT_MYCHR HYPOTHETICAL 13.1 KD HIT – LIKE PROTEIN IN P... 59.0 3e-09
sp|P26724|YHIT_AZOBR HYPOTHETICAL 13.2 KD HIT – LIKE PROTEIN IN H... 57.6 9e-09
sp|P32084|YHIT_SYNP7 HYPOTHETICAL 12.4 KD HIT – LIKE PROTEIN IN P... 55.7 3e-08
sp|P53795|YHIT_CAEEL HYPOTHETICAL HIT – LIKE PROTEIN F21C3.3 54.3 9e-08
sp|P42856|ZB14_MAIZE 14 KD ZINC – BINDING PROTEIN （PROTEIN KINASE... 52.8 2e-07
sp|P42855|ZB14_BRAJU 14 KD ZINC – BINDING PROTEIN （PROTEIN KINASE... 50.2 1e-06
sp|P49774|YHIT_MYCLE HYPOTHETICAL 17.0 KD PROTEIN HIT – LIKE PROT... 49.5 2e-06
sp|P49773|IPK1_HUMAN PROTEIN KINASE C INHIBITOR 1 （PKCI – 1） 49.1 3e-06
sp|P16436|IPK1_BOVIN PROTEIN KINASE C INHIBITOR 1 （PKCI – 1） （17 ... 48.7 4e-06
sp|P44956|YCFF_HAEIN HYPOTHETICAL HIT – LIKE PROTEIN HI0961 47.3 1e-05
sp|P43424|GAL7_RAT GALACTOSE – 1 – PHOSPHATE URIDYLYLTRANSFERASE 41.0 8e-04
Pass3:
sp|Q03249|GAL7_MOUSE GALACTOSE – 1 – PHOSPHATE URIDYLYLTRANSFERASE 87.2 1e-17
sp|P07902|GAL7_HUMAN GALACTOSE – 1 – PHOSPHATE URIDYLYLTRANSFERASE 79.8 2e-15
sp|P31764|GAL7_HAEIN GALACTOSE – 1 – PHOSPHATE URIDYLYLTRANSFERASE 64.7 6e-11
sp|P09148|GAL7_ECOLI GALACTOSE – 1 – PHOSPHATE URIDYLYLTRANSFERASE 62.5 3e-10
sp|P22714|GAL7_SALTY GALACTOSE – 1 – PHOSPHATE URIDYLYLTRANSFERASE 58.1 6e-09
sp|P09580|GAL7_KLULA GALACTOSE – 1 – PHOSPHATE URIDYLYLTRANSFERASE 48.5 4e-06
sp|P08431|GAL7_YEAST GALACTOSE – 1 – PHOSPHATE URIDYLYLTRANSFERASE 40.8 0.001
Pass4:
sp|P40908|GAL7_CRYNE GALACTOSE – 1 – PHOSPHATE URIDYLYLTRANSFERASE 71.0 8e-13
sp|P13212|GAL7_STRLI GALACTOSE – 1 – PHOSPHATE URIDYLYLTRANSFERASE 57.0 1e-08
圖7.12、使用PSI-BLAST后，敏感性提高很大：在這次BLASTP搜索中，查詢序列是人類組氨酸三聯(lián)體（HIT）蛋白（Swiss-Prot P49789），搜索時(shí)開(kāi)啟了PSI-BLAST功能。在每一次重復(fù)搜索中，新檢索出來(lái)的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的匹配都會(huì)顯示它們的定義行，打分值以及E 數(shù)值。
低復(fù)雜度區(qū)域
不管是蛋白還是核酸都包含一些偏頗的區(qū)域，在進(jìn)行序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索時(shí)這些區(qū)域可能會(huì)導(dǎo)致一些令人迷惑的結(jié)果。這些低復(fù)雜度區(qū)域（LCRs）在從明顯的同性聚合順串和短周期重復(fù)到更精細(xì)的情況（如其中某些或一些殘基過(guò)多表現(xiàn)）的范圍內(nèi)變化。一個(gè)稱為SEG的程序發(fā)展起來(lái)，目的是要把一個(gè)蛋白質(zhì)序列分解為低復(fù)雜度和高復(fù)雜度組成的各個(gè)片段（Wootton ａnd Federhen, 1993, 1996）。這個(gè)程序的結(jié)果表明數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)有一半以上擁有至少一個(gè)LCR（Wootton ａnd Federhen, 1993; Wootton, 1994）。LCRs的進(jìn)化、功能和結(jié)構(gòu)性質(zhì)并沒(méi)有被很好地了解。在DNA中，有許多種簡(jiǎn)單的重復(fù)，其中一些已經(jīng)知道是高度多樣性的，并且在作基因圖譜時(shí)經(jīng)常使用的。它們?cè)雌鸬臋C(jī)制可能是聚合酶滑動(dòng)、偏頗核苷酸取代或者不等交換。LCRs更偏好于在結(jié)構(gòu)上以非球形區(qū)域的形式存在，那些在物理化學(xué)上已經(jīng)被定義為非球形的區(qū)域通�？梢栽谑褂�SEG程序時(shí)獲得較好的結(jié)果（Wootton, 1994）。
對(duì)于包含LCR的序列進(jìn)行比對(duì)是成問(wèn)題的，因?yàn)檫@些序列不符合殘基-殘基序列守恒的模型。有些時(shí)候，與功能相關(guān)的屬性可能僅僅是周期性或組成結(jié)構(gòu)，而不是任何特異的序列。而且，對(duì)比對(duì)作統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析的方法是建立在一定的隨機(jī)概念基礎(chǔ)上的，LCR顯然不符合這一條件，因此，對(duì)于一個(gè)包含LCR的查詢序列，在進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的輸出里會(huì)發(fā)現(xiàn)很多不正確的條目，因?yàn)檫@些匹配的顯著性被過(guò)高評(píng)價(jià)了（Altschul et al., 1994）。這個(gè)問(wèn)題大體上可以通過(guò)過(guò)濾（或者叫屏蔽）解決，操作是這樣的，把有問(wèn)題的子序列轉(zhuǎn)化為不明確的字符（蛋白質(zhì)用X，核酸序列用N），這樣它們就不會(huì)對(duì)比對(duì)貢獻(xiàn)正分了。
果蠅鱗甲基因產(chǎn)物的人類同源物就是包含LCR蛋白質(zhì)的一個(gè)好例子，在用SEG分析的時(shí)候，兩個(gè)低組成復(fù)雜度的序列區(qū)域被鑒定出來(lái)。圖7.13a顯示了缺省的樹(shù)輸出，其中低復(fù)雜度序列用小寫(xiě)字母表示在左邊，高復(fù)雜度序列在右邊用大寫(xiě)字母表示。個(gè)區(qū)域片段有61個(gè)殘基，包含大量丙氨酸（alanine）和谷氨酸鹽（glutamine）的多聚物；第二個(gè)區(qū)域片段有14個(gè)殘基，偏向于精氨酸（arginine）。如果不進(jìn)行過(guò)濾的話，許多包含這種偏向性序列的數(shù)據(jù)庫(kù)序列都會(huì)被報(bào)告出來(lái)。使用命令行選項(xiàng)，SEG程序就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)過(guò)濾后的查詢序列版本。另外，過(guò)濾可以有BLAST程序自動(dòng)完成，如果使用合適的參數(shù)。請(qǐng)注意在使用BLAST時(shí)，缺省情況下就可以實(shí)行過(guò)濾（比如在WWW版本）。這就解釋了為什么查詢序列中的不明確的字符串（在原序列中沒(méi)有出現(xiàn)）會(huì)在比對(duì)中被偶然發(fā)現(xiàn)。
a
>gi|1703441|sp|P50553|ASH1_HUMAN ACHAETE – SCUTE HOMOLOG 1
1-11 MESSAKMESGG
agqqpqpqpqqpflppaacffataaaaaaa 12-72
aaaaaaqsaqqqqqqqqqqqqqqapqlrpa
a
RRLNFSGFGYSLPQQQP
aavarrnerernrv 120-133
SAVEYIRALQQLLDEHDAVSAAFQAGVLSP
TISPNYSNDLNSMAGSPVSSYSSDEGSYDP
LSPEEQELLDFTBWF
b
>gi|1703441|sp|P50553|ASH1_HUMAN ACHAETE – SCUTE HOMOLOG 1
MESSAKMESGGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXDGQPSGGGHKSAPKQVKRQRSSSPELMRCKRRLNFSGFGYSLPQQQPX
XXXXXXXXXXXXXKLVNLGFATLREHVPNGAANKKMSKVETLRSAVEYIRALQQLLDEHD
AVSAAFQAGVLSPTISPNYSNDLNSMAGSPVSSYSSDEGSYDPLSPEEQELLDFTBWF
c
>gi|540240 （U14590） achaete – scute homolog b [ Danio rerio ]
Length – 195
Score – 193 bits （512）, Expect – 7e-49
Identities – 107/155 （69%）, Positives – 118/155 （76%）
Gaps – 8/155 （5%）
QUERY 86 KQVKRQRSSSPELMRCKRRLNFSGFGYSLPQQQPXXXXXXXXXXXXXXKLVNLGFATLRE 145
K +KRQRSSSPEL+RCKRRL F+G GY++PQQQP K VN+GF TLR+
540240 32 KVLKRQRSSSPELLRCKRRLTFNGLGYTIPQQQPMAVARRNERERNRVKQVNMGFQTLRQ 91
QUERY 146 HVPNGAANKKMSKVETLRSAVEYIRALQQLLDEHDAVSAAFQAGVLSPTISPNYSNDLNS 205
HVPNGAANKKMSKVETLRSAVEYIRALQQLLDEHDAVSA Q GV SP++S YS
540240 92 HVPNGAANKKMSKVETLRSAVEYIRALQQLLDEHDAVSAVLQCGVPSPSVSNAYS－－－－- 146
QUERY 206 MAG—SPVSSYSSDEGSYDPLSPEEQELLDFTNWF 238
AG SP S+YSSDEGSY+ LS EEQELLDFT WF
540240 147 -AGPESPHSAYSSDEGSYEHLSSEEQELLDFTTWF 180
圖7.13、使用SEG程序檢索低復(fù)雜度區(qū)域：使用SEG程序?qū)θ祟?/font>achaete-scute蛋白（Swiss-Prot P50553）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了兩段低復(fù)雜度區(qū)域。（a）.以缺省的“tree”格式執(zhí)行程序得到的輸出結(jié)果，左邊用小寫(xiě)字母顯示了低復(fù)雜度區(qū)域，右邊用大寫(xiě)字母顯示了高復(fù)雜度區(qū)域。 （b） .開(kāi)啟-x命令行開(kāi)關(guān)，SEG程序?qū)?huì)產(chǎn)生把低復(fù)雜度區(qū)域屏蔽掉的序列結(jié)果。 （c）.為了方便使用，操作者可以使用BLAST程序來(lái)進(jìn)行低復(fù)雜度區(qū)域的屏蔽。當(dāng)一個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域被屏蔽掉的序列作為查詢序列被提交給數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索時(shí)，在BLASTP輸出結(jié)果的比對(duì)中可能也會(huì)包括一些被屏蔽的分段序列。
重復(fù)元件
如果查詢中包括一個(gè)重復(fù)元件的序列-比如說(shuō)一個(gè)Alu重復(fù)-可能會(huì)出現(xiàn)許多錯(cuò)誤的和令人費(fèi)解的結(jié)果。雖然在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)搜索中，這一般不會(huì)成為什么大問(wèn)題，但是在包含DNA序列任何比較中，都必須對(duì)此引起必要的重視�；蚪M序列可能會(huì)包含大量分散的重復(fù)序列，特別是一些多基因族（例如Alus, LINEs和人的序列中的MERs），甚至mRNA序列中也可能含有重復(fù)序列，幾乎都是信息的非翻譯區(qū)。因此，重復(fù)元件在數(shù)據(jù)庫(kù)序列中非常普遍，如果查詢序列中也有這些重復(fù)，就會(huì)在比對(duì)中出現(xiàn)大量不正確的正分。雖然重復(fù)元件顯示了大量不同成分，仍然有足夠的相似性使比對(duì)具有一定的高顯著性。雖然比對(duì)會(huì)跨越這些重復(fù)而不是側(cè)面的單一序列，但是直接從數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的輸出結(jié)果觀察，這并不是顯而易見(jiàn)的。
GenBank和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中都包含一些“暖序列（warming sequence）”，這些數(shù)據(jù)向使用者指出查詢中包含重復(fù)序列（Claverie ａnd Makalowski, 1993）。在GenBank中，這些條目表示了人類Alu重復(fù)的不同亞科的一致序列；在Swiss-Prot中的類似條目是Alu序列的六種翻譯框架（一個(gè)接著一個(gè)，中間由若干X分隔）。在兩種情況下，單詞“WARNING”在定義行中非常顯著。暖序列不必出現(xiàn)在命中列表的上方，而且，可以有許多包含Alu重復(fù)的數(shù)據(jù)庫(kù)序列同查詢序列非常相似，甚至比查詢序列同暖序列還相似。這在圖7.14a中有所體現(xiàn)，它顯示了對(duì)人類轉(zhuǎn)錄因子CBFB（在3’UTR包含一個(gè)Alu）基于nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行一次blastn搜索的一部分命中。暖序列（用箭頭標(biāo)出）位于命中列表的第31位。雖然列表頂部的一些匹配顯示了真正的關(guān)系（個(gè)是一個(gè)自命中），絕大多數(shù)只是因?yàn)榫哂?/font>Alu重復(fù)才會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的正分。
在查詢中更直接地檢測(cè)Alu重復(fù)是否存在的方法就是在查詢前先對(duì)alu數(shù)據(jù)庫(kù)做一次搜索。如圖7.14b所示，做完這個(gè)以后，包含alu的暖序列作為分匹配被報(bào)告出來(lái)。如果查詢序列被發(fā)現(xiàn)包含重復(fù)元件，接下來(lái)的行動(dòng)就是要對(duì)這個(gè)序列進(jìn)行編輯改動(dòng)，把它剔除或者屏蔽掉。在這里一個(gè)有用的工具就是CENSOR，它能夠自動(dòng)檢測(cè)并且消除重復(fù)元件。
a
Smallest
Sum
High Probability Y
Sequences producing High – scoring Segment Pairs: Score P（N） N
gb|L20298|HUMCBFB Homo sapiens transcription factor... 8691 0.0 2
dbj|D14571|MUSPEBP2B2 Mouse mRNA for PEBP2B2 protein, co.. 2574 0.0 25
gb|L032791|MUSP215CBF Mus musculus core – binding factor m 2574 0.0 25
dbj|D14572|MUSPEBP281 Mouse mRNA for PEBP2B1 protein, co.. 2130 0.0 26
dbj|d14570|muspebp283 Mouse mRNA for PEBP2B4 protein, co.. 1701 0.0 26
gb|L03305|MUSCBFAA Mus musculus core – binding factor m 942 0.0 27
gb|L03306|MUSCBFAB Mus musculus core – binding factor m 2130 1.6e-282 10
gb|U22177|DMU22177 Drosophila melanogaster Big brothe... 382 1.5e-37 2
emb|Y10196|HSPEX H.sapins PEX gene 400 4.4e-22 1
gb|L77570|HMUDGCRCEN Homo sapiens DiGeorge syndrome cri... 409 6.7e-22 2
gb|AD00067|1010603 Homo sapiens DNA from chromosome 1... 392 2.0e-21 1
emb|Z83822|HS306D1 Human DNA sequence from PAC 306D1 ... 392 2.0e-21 1
emb|Z82097|HSF77D12 Human DNA sequence from fosmid F77... 391 2.5e-21 1
dbj|D42052|HUMKIAA000 Human cosmid Q7A10 （D21S246） inser... 391 2.5e-21 1
gb|U83511|HSUB3511 Human Xp22 cosmids U177G4,U152H5, ... 386 6.5e-21 1
gb|U52112|HSU52112 Human Xq28 genomic DNA in the regi... 386 6.5e-21 1
gb|S83170|S83170 tissue – type plasminogen activator.. 382 1.1e-20 1
emb|X9642|HSCAMF3X1 H.sapiens Y chromosome cosmid CAMF... 383 1.1e-20 1
gb|U95739|HSU95739 Human chromosome 16p11.2 – p12 BAC c. 383 1.1e-20 1
gb|95743|HSU95743 Human chromosome 16p13.1 BAC clone... 383 1.1e-20 1
gb|U91322|HSU91322 Human chromosome 16p3 BAC clone C.... 383 1.1e-20 1
gb|U82609|HSU82609 Human centromere – specific histone.. 382 1.3e-20 1
gb|AC001061|HSAC001061 Homo sapiens （subclone 2_g6 fromP.... 382 1.3e-20 1
emb|Z46940|HSPRMTNP2 H.sapiens PRM1 gene, PRM2 gene and... 382 1.4e-20 1
gb|K03021|HUMTPA Human tissue plasminogen activator... 382 1.4e-20 1
gb|U15422|HSU15422 Human protamine 1 （PRM1）, protamin... 382 1.4e-20 1
gb|U91323|HSU91323 Human chromosome 16p13 BAC clone C... 382 1.4e-20 1
emb|Z54147|HSLI29H7A Human DNA sequence from cosmid L12... 381 1.7e-20 1
emb|Z82194|HSJ272J12 Human DNA sequence fom clone J272J12 374 1.7e-20 2
dbj|D0035|HIV2CAM2 Human immunodeficiency virus type-... 380 2.0e-20 1
à gb|U14567|HSU14567 ***ALU WARNING: Human Alu_J subfam... 373 2.4e-20 1
gb|L81578|HSL81578 Homo sapiens （subclone 2_b2 from P... 386 3.0e-20 2
gb|L81854|HSL81854 Homo sapiens （subclone 2_b8 from P... 377 3.4e-20 1
b
Smallest
Sum
High Probability Y
Sequences producing High – scoring Segment Pairs: Score P（N） N
à lcl|HSU14567 ***ALU WARNING: Human Alu – J subfamil... 373 4.1e-24 1
lcl|unknown gb|M94643_HSAL001949 349 1.4e-22 1
lcl|HSU14574 ***ALU WARNING: Human Alu – Sx subfami... 347 7.0e-22 1
lcl|HSU14573 ***ALU WARNING: Human Alu – Sq subfami... 347 7.0e-22 1
lcl|unknown gb|Z15026_HSAL001005 （Alu – J） 324 1.4e-21 1
lcl|unknown gb|M15657_HSAL001254 （Alu – J） 337 6.3e-21 1
lcl|unknown gb|M61839_HSAL002304 （Alu – J） 314 6.6e-21 1
lcl|unknown gb|X17354_HSAL000525 （Alu – J） 329 6.6e-21 1
lcl|HSU14572 ***ALU WARNING: Human Alu – Sp subfami... 329 2.4e-20 1
lcl|unknown gb|J03619_HSAL001939 （Alu – Sx） 329 2.8e-20 1
lcl|unknown gb|L11910_HSAL002838 （Alu – J） 307 2.8e-20 1
lcl|unknown gb|M11228_HSAL002744 （Alu – Sp） 329 2.9e-20 1
lcl|unknown gb|L18035_HSAL004322 （Alu – J） 318 9.3e-20 1
lcl|unknown gb|L05367_HSAL002551 （Alu – J） 318 1.0e-19 1
lcl|unknown gb|M58600_HSAL002004 （Alu – J） 322 1.2e-19 1
lcl|unknown gb|Z23796_HSAL005276 （Alu – J） 306 1.7e-19 1
lcl|unknown gb|M90058_HSAL002955 （Alu – J） 294 2.5e-19 1
lcl|unknown gb|D14642_HSAL003786 （Alu – J） 315 4.0e-19 1
lcl|unknown gb|M29038_HSAL002942 （Alu – J） 314 5.5e-19 1
lcl|unknown gb|M92357_HSAL001387 （Alu – J） 310 9.8e-19 1
圖7.14、反復(fù)元件可能會(huì)導(dǎo)致令人迷惑的結(jié)果：本次blastn查詢使用的查詢序列是人類轉(zhuǎn)錄因子CBFB（GenBank L20298）的cDNA序列。（a）.如果使用nr數(shù)據(jù)庫(kù)，*先的一些匹配同查詢序列具有真正的關(guān)聯(lián)，但是也會(huì)報(bào)告許多不正確的命中結(jié)果，這些命中分布于各個(gè)人類染色體的基因組區(qū)域。在這個(gè)命中列表中，打箭頭處（位于第31行）的一致的Alu-J序列被列為警告序列。 （b）.如果使用alu數(shù)據(jù)庫(kù)，Alu-J警告序列就成了*佳匹配序列。
為了鑒定這些潛在的搜索成果，學(xué)會(huì)怎樣評(píng)估搜索結(jié)果非常重要。上述的一些策略只應(yīng)用于Alu反復(fù)，它是人類以及其它一些物種中出現(xiàn)頻率的，但是其它一些反復(fù)仍然存在，雖然含量較低，而且，其它物種會(huì)顯示出完全不同類型的反復(fù)元件。現(xiàn)在有一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索輸出的附加性質(zhì)，它可以指示出反復(fù)元件。例如，注意比對(duì)中與DNA序列編碼區(qū)域相關(guān)的位點(diǎn)是非常有益的。如果非編碼區(qū)域匹配而編碼區(qū)域不匹配，那么反復(fù)序列就很令人懷疑；如果查詢序列同大量序列匹配，但是這些序列相互之間沒(méi)有什么關(guān)系，但是比對(duì)的分值都很相近，這樣的結(jié)果就極為可疑。例如圖7.14a中，許多匹配的相似性分值都幾乎一樣，而且包括了從若干不同的人類染色體上來(lái)的質(zhì)粒。雖然對(duì)這個(gè)發(fā)現(xiàn)有很多解釋，但是一個(gè)明智的看法就是至少承認(rèn)這個(gè)現(xiàn)象可能是出于外界因素（如反復(fù)元件的存在）的影響。
小結(jié)
在世界各地科學(xué)家們每天都要執(zhí)行序列比對(duì)和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索成千上萬(wàn)此，并且所有的分子生物學(xué)都應(yīng)該熟悉這些要緊的工具。這些方法注定要不斷發(fā)展，并且接受不斷增長(zhǎng)的數(shù)據(jù)庫(kù)容量的挑戰(zhàn)。特別是當(dāng)可利用的信息增長(zhǎng)時(shí)，使用者更加難以解釋其結(jié)果。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索工作臺(tái)致力于事后處理搜索結(jié)果并且圖形顯示，從而解決這一問(wèn)題。這些策略的例子包括PowerBLAST（Zhang ａnd Madden, 1997），BLIXEM（Sonnhammer ａnd Durban, 1994）和BEAUTY（Worley et al., 1995）。
這一章描述了數(shù)據(jù)比較的一些基本概念，但是使用大量不同的程序以獲得更詳盡的信息非常有用。研究人員應(yīng)該了解程序工作的基本操作，并且選擇相應(yīng)的參數(shù)。此外，他們應(yīng)該了解潛在的外部影響并且知道如何避免。*重要的是，應(yīng)該結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法的發(fā)現(xiàn)和評(píng)估事物的強(qiáng)大威力。
第七章中涉及到的可以在互聯(lián)網(wǎng)上使用（獲得）的軟件：
| CULSTAL.W | ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/ |
| DOTTER | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/dotter/ |
| LALIGN.FASTA | ftp://ftp.virginia.edu/pub/fasta/ |
| BLAST | ftp://ncbi.nlm.nih.gov/blast/ |
| SEG | ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/seg/ |
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